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动态液体—静电纺新型三维支架的制备、表征及生物相容性

作　者: 李珺
导　师: 莫秀梅
学　校: 东华大学
专　业: 生物化学与分子生物
关键词: 动态液体-静电纺三维支架纳米纱纤维增强组织工程
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

骨是人体重要的支撑结构,具有保护器官和执行造血等功能。大块骨缺损是骨科面临的一大难题。组织工程为骨缺损的修复提出了新途径。支架、种子细胞、生长因子是组织工程的三要素。骨组织工程支架基本目的是尽可能模仿和接近松质骨的机械性能和结构。骨细胞外基质(extracellular matrix, ECM)由非矿化的有机组分和矿化的刚性无机物质组成。由于ECM在细胞的生长过程中起着至关重要的调控作用,构建具有类似ECM结构与功能的支架是组织工程的关键技术之一。本论文采用动态液体-静电纺技术制备了两类新型可降解的纳米纤维三维支架,分别采用磷酸-钙液交替浸渍法和模拟体液(SBF)浸渍法仿生矿化,模拟天然骨组织的结构和成分。使用MC3T3-E1细胞研究两类支架的生物相容性,为骨组织工作支架的构建提供新的方法。主要研究内容如下：(1)首次采用改良的动态液体-静电纺技术制备了丝素蛋白(silk fibroin,SF)与P(LLA-CL)混纺纳米纱和单纯P(LLA-CL)的纳米纱三维支架,用磷酸-钙液交替浸渍法仿生矿化。通过扫描电子显微镜和红外光谱、X射线衍射光谱分析矿化前后两种纳米纱的结构和理化性质。研究结果表明,纳米纱是由多根纳米纤维成股而形成的。在组成单元上,P(LLA-CL)纳米纱比SF与P(LLA-CL)混纺的纳米纱直径更大,同时宏观结构更规则。SF与P(LLA-CL)的混纺后,通过水的接收,能够使得SF快速转变为不溶于水的B-折叠的silk II结晶结构。红外光谱、X射线衍射光谱分析证实通过磷酸-钙液交替浸渍法能够使得支架上沉积羟基磷灰石颗粒。细胞相容性实验表明,由纳米纤维形成的纳米纱极大地影响细胞的粘附和迁移行为。纯聚合物材料的P(LLA-CL)由于疏水的表面缺乏细胞粘附的功能性基团,不利于细胞增殖,混合有SF的纳米纱支架能够有效促进细胞增殖。MC3T3-E1细胞在矿化前后两种支架上都能够增殖,其中P(LLA-CL)/SF、P(LLA-CL)-HA和P(LLA-CL)/SF-HA支架上的细胞数量出现显著性增殖(P>0.05)。通过HE染色证明,在矿化前后的纳米纱支架上都发现了细胞的长入,细胞沿着纤维生长,呈现沿着纤维的走向迁移,遍布了整个支架中。本实验结果证明,改良的动态液体-静电纺技术能够提供一种用于组织工程三维支架材料的制备方法,制备的三维纳米纱能够克服传统静电纺制备出的纳米纤维膜导致细胞难以长入支架内部的缺点,有望应用于骨组织修复。(2)为了增强三维结构的纳米纤维的力学性能,本研究利用纤维增强的原理结合冷冻干燥技术,制备了新型P(LLA-CL)和P(LLA-CL)/SF纳米纱增强丝素蛋白的复合型三维支架,使用75%乙醇蒸汽诱导支架的水不溶性。采用10×SBF浸渍法来进行支架的仿生矿化。结果表明纤维增强这一方式对复合支架的孔隙率,力学性能有着巨大的影响。随着纳米纱的加入,相比纯SF支架,两种纤维增强型复合支架的孔隙率有一定程度的下降,同时力学性能得到明显的增加。纯SF支架的弹性模量为1.2848±0.1107MPa,孔隙率约为86.28%。PLCL-R-SF支架的弹性模量增加到1.17017±O.1619MPa,孔隙率降低至84.97%,而PLCL/SF-R-SF支架的弹性模量的弹性模量增加到1.7265±0.5042MPa,孔隙率降低至82.82%。矿化沉积的结晶颗粒的钙磷比(Ca/P)为1.56,接近羟基磷灰石的Ca/P=1.67。红外光谱、X射线衍射光谱分析进一步证实通过10×SBF浸渍法能够使得支架上沉积球型的羟基磷灰石颗粒。PLCL-R-SF-HA和PLCL/SF-R-SF-HA支架上的细胞数量有了显著性的增加(P>0.05),同时MC3T3-E1在支架上已经分泌出了自身的明显的细胞外基质。说明在纳米水平上球状的羟基磷灰石颗粒可能会减少MC3T3-E1细胞在支架上早期的增殖,但是在后期羟基磷灰石对细胞增殖起了明显的促进作用。本实验结果证明,纤维增强这一方式能够极大的提高三维纳米纤维支架的力学强度,纤维增强型复合支架在骨组织修复中具有良好的应用潜能。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
1 绪论  11-25
  1.1 骨组织的结构和骨组织工程支架  11-12
  1.2 骨组织工程支架  12-15
    1.2.1 天然高分子材料  13-14
    1.2.2 合成聚合物  14-15
  1.3 骨组织支架的制备和静电纺丝技术  15-21
    1.3.1 静电纺装置和原理  16
    1.3.2 无纺布纤维膜  16-17
    1.3.3 取向纳米纤维膜  17
    1.3.4 纳米纱  17-19
    1.3.5 静电纺制备三维组织工程支架  19-21
  1.4 骨的生物力学与仿生矿化  21-23
  1.5 本论文的研究内容、创新点及意义  23-25
2. 纳米纱三维支架的制备和表征  25-38
  2.1. 前言  25-26
  2.2 实验部分  26-30
    2.2.1 实验材料  26
    2.2.2 实验仪器  26-27
    2.2.3 再生丝素的提取  27
    2.2.4 纺丝液的配置  27
    2.2.5 纳米纱三维支架的制备  27-29
    2.2.6 纳米纱三维支架的形貌表征  29-30
    2.2.7 支架的仿生矿化  30
    2.2.8 矿化支架的形貌表征  30
    2.2.9 红外光谱测试  30
    2.2.10 X射线衍射测试  30
    2.2.11 热重分析  30
  2.3 结果与讨论  30-37
    2.3.1 不同质量比对纳米纱支架形貌的影响  30-32
    2.3.2 循环次数对纳米纱三维支架矿化形貌的影响  32-33
    2.3.3 红外光谱分析  33-35
    2.3.4 X-射线衍射分析  35-36
    2.3.5 热重分析  36-37
  2.4 本章小结  37-38
3. 纳米纱增强型复合支架的制备、表征  38-52
  3.1. 前言  38
  3.2 实验部分  38-42
    3.2.1 实验材料  38-39
    3.2.2 实验仪器  39-40
    3.2.3 再生丝素的提取及纺丝液的配制  40
    3.2.4 纳米纱三维纳米纤维支架的制备  40
    3.2.5 纳米纱增强型复合支架的制备  40-41
    3.2.6 复合支架的形貌表征及孔隙率  41
    3.2.7 力学性能测试  41
    3.2.8 支架的仿生矿化  41
    3.2.9 矿化支架的形貌表征及X射线散射能谱(EDS)  41-42
    3.2.10 红外光谱测试  42
    3.2.11 X射线衍射测试  42
  3.3 结果与讨论  42-51
    3.3.1 丝素蛋白浓度对复合支架形貌的影响  42-44
    3.3.2 纳米纱对复合支架孔隙率和表观密度的影响  44
    3.3.3 力学性能  44-45
    3.3.4 不同浸泡时间对矿化支架形貌的影响  45-47
    3.3.5 X-射线散射能谱分析  47
    3.3.6 红外光谱分析  47-49
    3.3.7 X-射线衍射分析  49-51
  3.4 本章小结  51-52
4. 纳米纱三维支架和纳米纱增强复合支架的生物学评价  52-65
  4.1. 前言  52
  4.2 实验部分  52-56
    4.2.1 实验材料  52-53
    4.2.2 实验仪器  53-54
    4.2.3 材料制备  54
    4.2.4 材料处理  54
    4.2.5 细胞接种  54-55
    4.2.6 细胞冻存和复苏  55
    4.2.7 成骨诱导  55
    4.2.8 MTT实验  55-56
    4.2.9 统计学分析  56
    4.2.10 细胞在支架上生长的形貌观察  56
    4.2.11 HE染色  56
  4.3 结果与讨论  56-64
    4.3.1 复合支架上的MC3T3-E1细胞的增殖  56-58
    4.3.2 复合支架上的MC3T3-E1细胞形貌观察  58-60
    4.3.3 纳米纱支架上的MC3T3-E1细胞的增殖  60
    4.3.4 纳米纱支架上的MC3T3-E1细胞形貌观察  60-61
    4.3.5 纳米纱支架上的MC3T3-E1细胞行为  61-64
  4.4 本章小结  64-65
5 结论与展望  65-68
  5.1 实验结论  65-67
  5.2 后续工作建议  67-68
参考文献  68-74
附录攻读硕士学位期间科研及发表论文情况  74-75
致谢  75

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