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微生态制剂对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏NKT细胞功能的影响

作　者: 王晓静
导　师: 赵彩彦
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: CD1d 自然杀伤T细胞 非酒精性脂肪性肝炎 CXCL16 微生态制剂
分类号: R575.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)是以肝细胞脂肪变性、小叶内炎症伴灶性坏死为特征的一类遗传-环境-代谢应激相关性临床病理综合征。其发病机制尚未完全阐明。肝脏固有免疫及环境遗传等多种因素可能共同参与NASH的发生进展。目前微生态制剂作为临床辅助治疗肝脏病的药物应用较为广泛,但其对NASH的治疗作用尚不明确。本实验通过高脂饲料喂养大鼠建立NASH大鼠模型,并应用微生态制剂-双歧杆菌乳杆菌三联活菌给予大鼠灌胃,观察该药物对NASH大鼠肝损伤中肝组织CD1d、NKT细胞及CXCL16等指标及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) -α、白细胞介素(interleukin, IL) -12等Th1型细胞因子水平的影响,旨在探讨该药物在NASH中可能的治疗作用及其作用机制。方法:36只雄性健康Wistar大鼠随机分为正常对照A组(造模0周)、正常对照B组、高脂饮食8周、12周、16周组及双歧杆菌乳杆菌三联活菌治疗组。分别于造模0周、8周、12周、16周处死大鼠取材。并行HE、SudanⅣ、Masson染色,观察肝组织炎症、脂肪变性及纤维化程度;用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)观察肝组织CXCL16 mRNA、CD1d mRNA表达;免疫组织化学观察CXCL16蛋白的表达;流式细胞仪检测肝组织NKT细胞百分含量;全自动生化仪检测血清生化学指标;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定血清TNF-α、IL -12水平。结果:1一般表现:正常对照组大鼠皮毛有光泽、食欲佳,精神状态好,体重逐渐增加;高脂组大鼠精神萎靡,活动减少,食欲减退,皮毛欠光泽,体重增加明显;治疗组大鼠精神、食欲及活动介于正常对照组与高脂组之间。2血清学指标的变化2.1血清学指标的动态变化高脂8周、12周、16周组大鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平均较正常对照A组显著升高(P均<0.01),且随着造模时间延长而显著升高;血清TNF-α水平:高脂8周、12周、16周组分别为11.39±2.59、21.2±5.18、28.23±4.31,均较正常对照A组(5.92±1.68)显著升高(P均<0.01);IL-12水平:高脂8周、12周、16周组分别为49.493±8.024、68.392±7.302、78.957±12.434,均较正常对照A组(34.256±7.518)显著升高(P均<0.01),以上结果表明随着造模时间延长,大鼠血清TNF-α、IL-12水平逐渐升高。2.2微生态制剂对血清学指标的影响高脂16周组TC、TG、ALT、AST等指标分别为3.89±0.22、0.93±0.26、103.37±20.11、154.82±17.59,较正常对照B组上述各指标(1.87±0.19、0.55±0.25、35.38±12.47、73.54±10.63)均显著升高(P均<0.01);治疗组上述各指标分别为2.12±0.18、0.81±0.18、72.74±18.94、92.56±15.37,均较高脂16周组各指标显著下降(P<0.05);血清TNF-α:治疗组为18.66±3.54,显著低于高脂16周组(28.23±4.31)(P<0.01);IL-12水平:治疗组血清IL-12水平是37.562±7.557,显著低于高脂16周组(78.957±12.434)(P<0.01)。3肝组织病理变化:肉眼观察,正常对照组大鼠肝脏外观为红褐色,有光泽,质软;高脂组大鼠肝脏体积明显增大,颜色为浅黄色,切面油腻感;治疗组大鼠肝脏外观介于正常对照组和高脂组之间。光镜下,HE染色示正常对照组大鼠肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心呈放射状排列,肝索结构整齐;SudanⅣ染色示肝细胞无脂肪滴,胞浆呈蓝色;Masson三重染色示中央静脉及汇管区未见明显胶原纤维沉积。HE、SudanⅣ染色示高脂8周组大鼠部分肝细胞气球样变,胞浆内充满大量粉红色脂滴,脂变的肝细胞以中央静脉周围最为明显,中央静脉周围可见点状坏死;高脂12周组可见肝细胞肿胀程度加重,胞浆内粉红色脂滴增多,中央静脉周围有炎症细胞浸润,炎性细胞以单个核细胞为主,可见灶性坏死;高脂16周组大鼠肝细胞弥漫性脂肪变,可见肝细胞内充满粉红色脂滴,小叶内弥漫性肝细胞点、灶性坏死;治疗组大鼠肝细胞内粉红色脂滴明显减少,炎症细胞浸润明显减少。Masson三重染色示高脂8周组、12周组大鼠肝组织中央静脉、汇管区均未见明显胶原纤维;高脂16周组大鼠肝组织可见肝窦周围胶原纤维沉积;治疗组大鼠中央静脉、汇管区无明显胶原纤维沉积。4流式细胞仪测定肝脏NKT细胞的百分含量4.1肝脏NKT细胞的百分含量的动态变化高脂8周、12周、16周组肝脏NKT细胞百分比分别为(17.48±2.43)%、(15.08±1.81)%、(8.31±3.81)%,较正常对照A组肝脏NKT细胞百分比(25.26±2.56)%显著降低(P均<0.01),肝脏NKT百分比随着造模时间延长显著下降(P均<0.01)。4.2微生态制剂对肝脏NKT细胞百分比的影响高脂16周组肝脏NKT细胞百分比(8.31±3.81)%较正常对照B组(22.94±2.65)%显著降低;经微生态治疗后,肝脏NKT细胞百分比为(16.90±1.96)%,较治疗前显著升高(P<0.01)。5 RT-PCR检测CD1d mRNA﹑CXCL16 mRNA在大鼠肝组织的表达5.1大鼠肝组织CD1d mRNA﹑CXCL16 mRNA的动态变化大鼠肝组织CD1d mRNA表达:正常对照A组、高脂8周、12周、16周组大鼠肝组织CD1d mRNA相对含量分别为0.640±0.040、0.579±0.027、0.507±0.023、0.447±0.037,表明随着造模时间延长,大鼠肝组织CD1d mRNA表达显著下降(P均<0.01);CXCL16 mRNA表达结果显示,正常对照A组、高脂8周、12周、16周组大鼠肝组织CXCL16 mRNA相对含量分别为0.215±0.031、0.364±0.032、0.529±0.046、0.586±0.016,表明随着造模时间延长,CXCL16 mRNA显著升高(P均<0.01)。5.2微生态制剂对大鼠肝组织CD1d mRNA﹑CXCL16 mRNA表达影响高脂16周组大鼠肝组织CD1d mRNA的相对含量为0.447±0.037,较正常对照B组(0.666±0.027)显著降低;治疗组大鼠肝组织CD1d mRNA相对含量为(0.559±0.044),较治疗前显著升高(P<0.01);高脂16周组大鼠肝组织CXCL16 mRNA相对含量为0.586±0.016,较正常对照B组(0.217±0.034)显著升高;治疗组大鼠肝组织CXCL16 mRNA相对含量为0.375±0.035,较治疗前显著降低(P<0.01)。6免疫组织化学法检测CXCL16蛋白在大鼠肝组织的表达6.1大鼠肝组织CXCL16的动态变化正常对照组大鼠肝细胞浆内有CXCL16微弱表达,相对表达为0.5±0.837;高脂组大鼠肝组织表达CXCL16明显增强。高脂8周、12周、16周组大鼠肝组织CXCL16相对含量分别为10.67±1.862、21.0±2.898、25.67±4.844,均较正常对照A组表达显著升高(P均<0.01);大鼠肝组织CXCL16表达从0周到12周逐渐升高(P均<0.01),但在高脂饮食12周后无显著升高。6.2微生态制剂对大鼠肝组织CXCL16表达的影响高脂16周组大鼠肝组织CXCL16相对含量为25.6±4.844,较正常对照B组(0.67±1.211)显著升高(P<0.01);治疗组大鼠肝组织阳性表达细胞数减少,其CXCL16相对表达为8.67±2.805,较治疗前显著下降(P<0.01)。7相关分析表明,肝组织CD1d表达与肝组织NKT细胞百分含量存在直线相关,r值为0.774, P<0.01;肝组织NKT细胞百分含量与血清TNF-α水平、IL-12水平、肝组织CXCL16蛋白含量呈负相关,r值分别为-0.718、-0.767、-0.795,P值均<0.01。结论:1应用高脂饮食的方法可以成功制备NASH大鼠模型。高脂饮食可导致CD1d依赖性NKT细胞减少,功能障碍,促使Th1型促炎细胞因子释放。2 CXCL16在NASH大鼠肝组织炎症病变的发生发展中发挥着重要作用。3微生态制剂可通过提高肝脏NKT细胞免疫功能及抑制CXCL16表达,抑制Th1型促炎细胞因子释放而发挥抗炎症作用。

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-14
研究论文 微生态制剂对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏NKT 细胞功能的影响  14-50
  前言  14-15
  材料与方法  15-19
  结果  19-23
  附图  23-33
  附表  33-39
  讨论  39-46
  结论  46
  参考文献  46-50
综述 肝脏固有免疫在非酒精性脂肪性肝病中的作用  50-59
致谢  59-60
个人简历  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 消化系及腹部疾病 > 肝及胆疾病 > 肝炎
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