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超声介导携TFO脂质超声微泡对切应力诱导的内皮细胞组织因子表达的影响

作　者: 梁伟华
导　师: 赵士福
学　校: 第三军医大学
专　业: 神经病学
关键词: 超声检查 寡核糖核苷酸类 反义 微气泡 凝血致活酶 切应力
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


背景和目的:脑血栓形成或脑栓塞是中老年人群的常见疾病之一,其高发病率及高致残率严重影响中老年人群的身体健康。预防脑血栓形成或脑栓塞,对于降低脑血管病的高发病率或高残废率具有重要意义。近年研究表明,血管壁切应力诱导内皮细胞组织因子(TF)高表达是触发血管内血栓形成的主要始发因素之一。干预内皮细胞TF表达对预防或推迟切应力性血栓形成,降低血栓性疾病的发生有重要意义。本课题设计合成反向嘌呤寡核苷酸(TFO),后者可阻断TF基因启动子区的切应力反应元件(SSRE),从而阻断TF表达,降低切应力性血栓的形成。但研究发现TFO的细胞吸收率较低,对TF的抑制效率不明显。目前有研究发现,超声微泡在超声作用下可明显提高基因的转染率,本研究利用超声微泡技术联合超声辐照,观察TFO对TF的作用效率。本实验探讨通过构建携TFO脂质超声微泡,观察超声作用下TFO在内皮细胞和动物颈内狭窄处的吸收及TFO对TF的抑制作用,目的是验证超声辐照和携TFO脂质超声微泡的联合应用对TFO的吸收促进作用及对TF的抑制效率。为进一步探索将TFO开发为保护内皮细胞、抑制颈内动脉血栓形成新型药物提供实验基础,为预防血栓形成提供新的预防治疗途径。方法:1.构建携带TFO的脂质超声微泡。普通光镜下观察携TFO脂质超声微泡外观、形态。光学显微镜下观察携TFO脂质超声微泡的荧光标记情况。以Coulter颗粒计数仪、Zetasizer3000检测粒径和粒度分布、表面电位测定。2.超声介导携TFO脂质超声微泡对TFO在内皮细胞的吸收及TFO对TF的抑制作用:将ECV304细胞随机分为4组:空白对照(SSRE)组,仅接受切应力作用6h;TFO+超声辐照(TFO+U)组,取60μlTFO(终浓度0.2μmol/L)加入细胞,同时给予超声处理,超声治疗头频率1MHz,占空比0.5%,声强为1W/cm2 ,辐照作用时间30;TFO-脂质微泡(TFO-M)组,,取60μl携带TFO脂质超声微泡(终浓度0.2μmol/L)加入细胞。TFO-脂质微泡+超声辐照(TFO-M+U)组,取60μl携带TFO脂质超声微泡(终浓度0.2μmol/L)加入细胞,同时给予超声处理,各项参数同TFO+U组。后三组进行TFO转染后24h接受切应力(压强1.2Pa)作用6h。荧光显微镜观察TFO的细胞吸收率,免疫荧光法和RT-PCR分别检测TF蛋白和mRNA的表达。3.超声介导TFO脂质超声微泡对切应力诱导的大鼠颈动脉内皮细胞TF抑制作用:将制备的携TFO超声微泡临用前低速离心,用0.9%NaCl稀释成1.0mg·mL - 1混匀,在模型制备前0.5h按0.5mg·kg - 1尾静脉注入。SD大鼠随机分为4组:空白对照(SSRE)组:模型制备后6h处死;TFO+超声辐照(TFO+U)组:注入同等体积0.9% NaCl稀释成1.0 mg·mL - 1混匀的TFO,注射同时,在大鼠颈动脉位置放置超声探头进行照射,超声治疗头频率347KHz,声强为2.4MPa,辐照作用时间2min;TFO-脂质微泡(TFO-M)组:注射携带TFO脂质超声微泡;TFO-脂质微泡+超声辐照(TFO-M+U)组:注射携带TFO脂质超声微泡,注射同时,在大鼠颈动脉位置放置超声探头进行照射,各项参数同TFO+U组。建立颈动脉狭窄动物模型,在不同条件下,免疫荧光法检测颈动脉内皮细胞TF蛋白的表达。结果1.成功构建携TFO脂质超声微泡:经FITC标记的携TFO脂质超声微泡外观呈浅黄色混悬液。光镜下观察,携TFO脂质超声微泡均呈圆形,表面光滑,大小均匀,光镜密集分布,微泡浓度约为7×109/ml左右。荧光显微镜下携TFO脂质超声微泡表面发出明亮黄绿色荧光;普通脂质微泡荧光显微镜下不可见。说明微泡脂膜上已成功包载FITC标记的TFO。携带TFO的脂质超声微泡粒径分析结果显示:Intensity Mean :2092.8nm Volume Mean :2114.2nm Average Mean :2166.9nm。可见携带TFO的脂质超声微泡平均粒径为(2.20±0.35)μm,符合静脉注射要求。Zeta电位测定结果为-46.0±1.6mM,说明携带TFO的脂质超声微泡为阴离子脂质体。2.超声介导携TFO脂质超声微泡对TFO在内皮细胞的吸收及TFO对TF的抑制作用:1)荧光显微镜观察TFO的细胞吸收率:转染FITC-TFO的ECV304细胞内可见绿色荧光分布。三组均可见绿色荧光表达。TFO-M组、TFO+U组阳性细胞比TFO-M+U组明显减少。TFO-M组、TFO+U组绿色荧光表达较弱,主要分布于胞浆。TFO-M+U组可见明亮绿色荧光表达。图像分析:TFO-M+U组(38.83±6.52)的转染效率高于TFO-M组(9.50±2.88)和TFO+U组(12.66±3.01)(P<0.01) ,后两组间无显著差异。2)免疫荧光法检测TF蛋白表达:TF蛋白呈现为红色荧光细颗粒。SSRE组ECV304细胞见大量红色荧光细颗粒,主要分布在胞浆和胞膜区域,胞核可见少量红色荧光细颗粒。TFO+U组、TFO-M组和TFO-M+U组较SSRE组细胞红色荧光量均有不同程度降低;且以TFO-M+U组最为显著。图像分析表示:与SSRE组(74.00±16.67)比较,TF蛋白的平均灰度值在TFO+U组(36.83±8.34)、TFO-M组(40.77±9.40)和TFO-M+U组(13.98±6.39)中的表达降低(P<0.01);TFO-M+U组较TFO+U组和TFO-M组明显降低(P<0.01) ,后两组间无显著差异。3) RT-PCR检测TFmRNA表达:SSRE组可见明显扩增TF条带;TFO+U组和TFO-M组扩增TF条带较弱;TFO-M+U组扩增TF条带最弱。TFO+U组、TFO-M组和TFO-M+U组的TF和GAPDH的扩增带的密度比值表达分别为0.36±0.07、0.38±0.07和0.11±0.02与SSRE组(0.71±0.08)相比有所降低(P<0.01) ;TFO-M+U组明显低于TFO+U组和TFO-M组(P<0.01),后两组间无显著差异。3.超声介导TFO脂质超声微泡对切应力诱导的大鼠颈动脉内皮细胞TF抑制作用:成功建立颈动脉狭窄动物模型后,在不同条件下免疫荧光法检测颈动脉内皮细胞TF蛋白的表达:SSRE组颈动脉内膜内皮细胞表达TF蛋白阳性细胞数目及着色程度显著;TFO+U组、TFO-M组和TFO-M+U组较SSRE组颈动脉内膜内皮细胞表达TF蛋白均有不同程度降低;且以TFO-M+U组最为显著。图像分析表明:与SSRE组(71.78±7.10)比较,TF蛋白的平均灰度值在TFO+U组(51.22±5.69)、TFO-M组(55.22±6.47)和TFO-M+U组(20.59±4.38)中的表达降低(P<0.01);TFO-M+U组较TFO+U组和TFO-M组明显降低(P<0.01) ,后两组间无显著差异。结论:1.构建的携TFO脂质超声微泡造影剂表面带负电荷,粒径大小符合静脉注射要求,以脂质超声微泡为载体携带TFO是可行的,并成功制备了携TFO脂质超声微泡造影剂。2.体外实验以人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞作为研究对象进一步证实:TF表达下降与TFO在细胞内的增加相关, TFO的转染率越高,则TF表达越低,说明TFO可以有效抑制切应力诱导的内皮细胞TF的表达,而脂质超声微泡联合超声辐照可以显著增加内皮细胞对TFO的吸收率,从而促进TFO对TF的抑制作用。3.动物实验以颈动脉狭窄动物模型作为研究对象进一步证实:TFO可抑制切应力诱导的颈动脉内膜内皮细胞TF的表达,而脂质超声微泡联合超声辐照可以促进抑制作用的发挥,有利于预防切应力性血栓的形成。

全文目录


主要英文缩写词简表  5-6
英文摘要  6-11
中文摘要  11-15
论文正文 超声介导携 TFO 脂质超声微泡对切应力诱导的内皮细胞组织因子表达的影响  15-52
  前言  15-17
  第一部分 携TFO 脂质超声微泡的构建  17-25
    材料与方法  17-18
    结果  18-20
    讨论  20-22
    小结  22-23
    第一部分图片  23-25
  第二部分 超声介导携TFO 脂质超声微泡对TFO 的细胞吸收率及组织因子表达的影响  25-38
    材料与方法  25-29
    结果  29-33
    讨论  33-34
    小结  34-35
    第二部分图片  35-38
  第三部分 超声介导携 TFO 脂质超声微泡抑制切应力诱导的大鼠颈动脉内皮细胞组织因子表达  38-46
    材料与方法  38-40
    结果  40-41
    讨论  41-42
    小结  42-43
    第三部分图片  43-46
  全文结论  46-47
  致谢  47-48
  参考文献  48-52
文献综述 超声介导超声微泡造影剂在血栓性疾病治疗领域的应用  52-59
  参考文献  56-59
攻读硕士学位期间撰写的文章  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病 > 急性脑血管疾病（中风）
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