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重组腺病毒载体介导短发夹RNA共调控人脑胶质瘤细胞中miR-221/222的表达及功能的体外研究

作　者: 王轩
导　师: 申长虹；康春生
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胶质瘤 miR-221 miR-222 ShRNA 腺病毒载体基因治疗
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

MicroRNAs(miRNAs)是一组小的单链非编码RNA分子,是重要的基因负调控因子。这种靶基因表达的转录后调控的关键,被认为是靶RNA的3’非翻译区(3’UTR)与miRNA的5’种子区(Seed Region)的不完全碱基互补结合。鉴于靶基因的多样性和,miRNA似乎与多种作为抑癌基因与癌基因的细胞信号转导通路的成分在功能上互相作用,而组合产生了一个复杂的网络。以miRNA表达谱来检视这些网络,揭示了在多种肿瘤中这些分子存在广泛的失调,这表明在肿瘤发生中miRNA发挥了关键的作用。短发夹RNA(shRNA)是一种新的RNA干扰(RNAi)调控体,其包含事先设计的由一个环状结构分隔的反义链和正义链组成。shRNA被认为在细胞中被加工成具备功能的形式,即在正义链作为“过客链”释放后,反义链作为“引导链”使RISC活化。shRNA可以用来拮抗异常表达的miRNA而抑制肿瘤。近来有报道利用慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)干预调节肿瘤中异常表达miRNA的功能,较之传统反义技术只能对于癌基因进行逐个且效率较低的干预具有明显的优势。但慢病毒载体存在诸多缺点,同时某类肿瘤具有多种异常表达miRNA,且存在结构相近的miRNA簇,而上述研究中shRNA仅是靶向某种特定的miRNA。Ciafre等以及我们的先期研究利用基因芯片的方法均显示,miR-221/222在胶质母细胞瘤中显著上调。我们前期在体内体外实验中均证实,利用反义寡核苷酸共抑制miR-221和miR-222来直接上调p27kip1可以明显抑制肿瘤细胞的增殖。本实验中,我们利用载体融合技术成功设计了一种腺病毒介导的shRNA,在胶质瘤中可以功能性地共抑制miR-221和miR-222的表达,这样就克服了上述靶向miRNA的基因治疗的种种不足,使多种肿瘤相关的miRNA可以同时进行调控,并避免了慢病毒载体的诸多缺点,有希望成为一种高效的基因治疗策略。此外,我们在上述shRNA基础上,合成了一种衍生的shRNA。这种shRNA的3’端碱基,即与靶miRNA的5’种子区配对的区域被突变,因而减低了与miRNA结合的稳定性。实时定量PCR结果显示应用经典型shRNA可以达到对miRNA表达水平的最大抑制效果,次之以突变型shRNA和空白对照,呈一个明显的梯度。miR-221/222的直接靶点p27kip1的蛋白表达水平及其对细胞周期G1期阻滞的效应和细胞凋亡也出现了与之相应的梯度式半定量改变。这样,同时利用经典型和突变型shRNA,我们就可能达到利用RNAi技术对多种肿瘤相关miRNA的表达和功能进行多层次半定量地调控。这也可以为我们深入探索miRNA在肿瘤发生中的作用和相应基因治疗提供了方法学的基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-8
缩略语/符号说明  8-12
前言  12-17
  研究现状、成果  12-15
  研究目的、方法  15-17
一、突变型与经典型Ad-shmiR-221/222共表达腺病毒载体的构建及其鉴定  17-43
  1.1 引言  17-18
  1.2 对象和方法  18-30
    1.2.1 仪器和试剂  18-19
    1.2.2 shRNA的靶序列的选择  19
    1.2.3 shRNA表达框的设计与合成  19-20
    1.2.4 将shRNA表达框亚克隆至相应的腺病毒穿梭质粒上  20-23
    1.2.5 将两个腺病毒穿梭质粒融合以产生shRNA的共表达框  23-25
    1.2.6 从pGenesil-Co上通过LR体外同源重组将shmiR-221和shmiR-222的共表达框移至pGSadeno腺病毒表达载体上  25-26
    1.2.7 包装重组腺病毒  26-28
    1.2.8 重组腺病毒的扩增提取与滴度测定  28-30
  1.3 结果  30-37
    1.3.1 腺病毒穿梭质粒鉴定结果  30-32
    1.3.2 重组腺病毒载体鉴定结果  32-34
    1.3.3 包装后荧光验证重组腺病毒的产生  34-35
    1.3.4 重组腺病毒的扩增提取与滴度测定  35-37
  1.4 讨论  37-42
  1.5 小结  42-43
二、突变型与经典型Ad-shmiR-221/222共表达腺病毒载体在LN229和U251胶质瘤细胞中共调控miR-221和miR-222的表达和功能的体外研究  43-81
  2.1 引言  43-45
  2.2 对象和方法  45-57
    2.2.1 仪器和试剂  45-46
    2.2.2 细胞培养  46-47
    2.2.3 实验分组及重组腺病毒载体转导  47
    2.2.4 miRNA实时荧光定量PCR  47-50
    2.2.5 Western blot检测相关蛋白的表达  50-55
    2.2.6 流式细胞术分析细胞周期  55-56
    2.2.7 倒置相差显微镜观察形态  56
    2.2.8 Caspase-3/7萤光素酶法检测细胞凋亡  56-57
  2.3 结果  57-74
    2.3.1 加入氯仿后细胞裂解物分为三相  57
    2.3.2 微量紫外/可见分光光度计测定总RNA的浓度  57-58
    2.3.3 琼脂糖凝胶电泳观察总RNA  58
    2.3.4 微量紫外/可见分光光度计测定cDNA的浓度  58-59
    2.3.5 琼脂糖凝胶电泳观察cDNA  59-60
    2.3.6 miRNA实时荧光定量PCR  60-63
    2.3.7 Western blot检查miR-221/222目的蛋白的表达  63-69
    2.3.8 流式细胞术分析细胞周期  69-71
    2.3.9 倒置相差显微镜观察形态  71-72
    2.3.10 Caspase-3/7萤光素酶法检测细胞凋亡  72-74
  2.4 讨论  74-80
  2.5 小结  80-81
三、生物信息学分析突变型与经典型Ad-shmiR-221/222共表达腺病毒载体多层次半定量调控机制  81-88
  3.1 引言  81-82
  3.2 对象和方法  82
  3.3 结果  82-86
    3.3.1 确定shRNA引导链与靶miRNA形成的复合体的最佳三维结构  82-85
    3.3.2 检测shRNA引导链与靶miRNA形成的复合体的热力学稳定性  85-86
  3.4 讨论  86-87
  3.5 小结  87-88
结论  88-89
参考文献  89-93
发表论文和参加科研情况说明  93-94
综述  94-103
  miRNA与胶质瘤发病机制  94-99
  综述参考文献  99-103
致谢  103

重组腺病毒载体介导短发夹RNA共调控人脑胶质瘤细胞中miR-221/222的表达及功能的体外研究

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