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调控谷氨酸转运体对甲基苯丙胺致神经损伤的作用研究

作　者: 李成敏
导　师: 宫泽辉
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 甲基苯丙胺头孢曲松 GLT1 VGLUT1 清醒动物脑微透析
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH)是被广泛滥用的毒品之一,长期服药可造成多巴胺能神经元凋亡、引起严重的运动失调,学习记忆下降、认知和判断力丧失。METH可通过逆转多巴胺转运体的作用升高胞外多巴胺(dopamine, DA)浓度,激活纹状体-黑质的GABA能神经传导通路升高纹状体中谷氨酸(glutamate,Glu)浓度,对神经元产生损伤作用。胞外Glu水平是通过谷氨酸转运体和轴突终末释放的谷氨酸总量精确调控的。调控谷氨酸转运体的表达可缓解谷氨酸的兴奋性毒性,那么通过调控谷氨酸转运体的表达,减少突触间隙中Glu浓度是否能缓解METH所引起的神经损伤呢?因此,本实验研究如下:实验目的:探讨METH对神经元造成损伤时不同脑区谷氨酸转运体表达量的变化,调节谷氨酸转运体(GLT1和VGLUT1)的表达是否能缓解其神经损伤程度,以及GLT1和VGLUT1蛋白表达量的变化与DA、Glu、GABA释放的关系。实验方法:1.建立甲基苯丙胺致神经损伤的急性、亚急性处理动物模型。按照大鼠刻板行为评分标准,以大鼠出现重复的嗅探、摇头、抬头和旋转等刻板行为症状,评分结果大于2分为模型建立成功标准。2.采用尼氏染色法检测神经元中尼氏小体。完成行为学检测后的大鼠,麻醉后灌流,断头取脑、固定、脱水后进行冰冻切片,取含有皮层、海马、纹状体和伏隔核的切片并展片于多聚赖氨酸包被过的玻片上。尼氏染色后封片晾干,显微镜下观察,细胞呈现斑驳的蓝(紫)色染色。3.利用real-time PCR法检测VGLUT1与GLT1的mRNA水平的变化。TRizol法提取组织总RNA,以β-肌动蛋白作为内参物,分析谷氨酸转运体的mRNA表达变化。4.利用western-blot技术检测VGLUT1与GLT1蛋白表达的变化。分别提取不同脑区的蛋白,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电转移技术将蛋白质转至NC膜上,与相应的抗体结合,用化学发光法检测目的蛋白。5.利用清醒动物脑微透析技术,结合高效液相-荧光化学检测方法,测定大鼠纹状体等脑区胞外谷氨酸、甘氨酸和DA等神经递质的含量,分析甲基苯丙胺对不同脑区氨基酸释放的影响。实验结果:1.大鼠腹腔注射METH 5 mg·kg-1,10 mg·kg-1 , 20 mg·kg-1和40 mg·kg-1,能剂量依赖性地出现重复的嗅探、摇头、抬头和旋转等刻板行为,评分结果显示,除5 mg·kg-1剂量组大鼠刻板行为小于2分(1.4±0.5),与盐水对照组无显著差别外,其余3个剂量组刻板行的评分结果分别为(2.8±0.37)分、(3.2±0.2)分、(4.2±0.2)分,与盐水对照组比较均有统计学差异(P<0.05),其中40mg·kg-1组反应程度最强,与5、10、20mg·kg-1剂量组相比均有显著性差异。因此确定在后续试验中,METH急性处理模型的给药剂量为40 mg·kg-1;由于40 mg·kg-1组动物有明显的毒性反应症状,连续给药可造成死亡,所以在METH亚急性给药试验中剂量确定为10 mg·kg-1。2.谷氨酸转运体调节剂头孢曲松200 mg·kg-1 ip预防给药,对METH急性、亚急性处理所诱导的大鼠刻板行为增加(约为盐水对照组3.7倍)有明显的抑制作用,以刻板行为评分计算,头孢曲松预防组的评分约为METH对照组的67.5%。提示,调节谷氨酸转运体的表达,能够部分缓解METH所致的大鼠刻板行为的产生。3.尼氏染色试验结果显示,METH急性、亚急性给予大鼠后,可以导致纹状体神经元中尼氏小体显著减少,甚至消失;头孢曲松预防给药能够缓解METH对神经元的损伤情况。此结果进一步证明了METH致神经元损伤与兴奋性氨基酸毒性密切相关,增强谷氨酸转运体的功能可以显著改善METH对神经元的损伤。4.谷氨酸转运体VGLUT1位于突触前的囊泡膜上,负责将胞浆中的Glu转运入突触囊泡中,有兴奋性刺激时将其释放到突触间隙;GLT1位于中枢星状胶质细胞和神经元的细胞膜上,其功能是摄取突触间隙中的Glu,终止兴奋性传递。METH急性处理后,纹状体和伏隔核中VGLUT1蛋白表达与盐水对照组相比,分别增加66%、102%;GLT1蛋白的表达也明显增加,与盐水对照组相比,分别增加23%、53.7%。预防给予头孢曲松200mg·kg-1 ip后再给METH处理,可使纹状体和伏隔核VGLUT1蛋白表达降低,与METH对照组相比分别降低20%、56%;GLT1的水平进一步上调,比METH组分别增加15%、36%。经统计分析,各组间有显著性差异(P < 0.05)。此结果表明,头孢曲松不仅能够通过促进GLT1的表达减少突触间隙GLu浓度,同时抑制VGLUT1的表达减少Glu的释放量,综合效应是缓解了Glu的兴奋性毒性。5. METH亚急性处理显著增加大鼠纹状体、伏隔核、前额皮层和海马中GLT1蛋白的表达量,与盐水对照组相比,分别增加60%、40.9%、28.3%和68.6%;VGLUT1蛋白表达量与盐水对照组相比,在纹状体和伏隔核中分别增加66%、52.9%,在皮层和海马中增加不明显。头孢曲松预防给药后,GLT1蛋白表达量与METH组比较略有降低,降低幅度10~14%,无统计学意义;VGLUT1蛋白表达量的变化与急性处理相同,也成下降趋势,其中纹状体下降最明显(约20%)。6. METH亚急性处理显著上调大鼠纹状体和海马中GLT1mRNA水平,与盐水对照组相比,上调分别为90%、15%,对伏隔核和前额皮层中GLT1mRNA水平没有显著性影响;纹状体中VGLUT1mRNA水平,增幅达160%;伏隔核中VGLUT1mRNA水平降低约70%,前额叶皮层和海马中VGLUT1mRNA水平没有明显变化。头孢曲松预防给药后,纹状体和海马中VGLUT1mRNA水平与METH组相比,分别降低50%,40%;伏隔核中VGLUT1mRNA水平升高达140%,前额皮层中VGLUT1mRNA水平无显著性变化,纹状体、伏隔核、皮层和海马中GLT1mRNA水平与METH相比无显著性变化。7.清醒动物脑微透析结果显示,急性给予METH后,胞外Glu浓度持续增加,在本试验检测时间(0~6h)范围内,与基础平衡值相比,在给药5.5h时Glu浓度已增加450%。胞外DA水平在1h达峰值,与基础平衡值相比,浓度增加1248.6%。与METH组相比,头孢曲松预防给药可明显降低大鼠纹状体胞外Glu浓度(P < 0.05);抑制胞外DA水平升高,但1h时胞外DA水平与基础平衡值相比仍增加838.4%。实验小结:METH急性、亚急性处理均能引起大鼠不同脑区的神经损伤、胞外Glu浓度增加、谷氨酸转运体GLT1和VGLUT1蛋白表达发生变化;调节谷氨酸转运体表达,降低胞外Glu浓度,能够减少METH引起的大鼠刻板行为和缓解神经元损伤。以上试验结果证明,METH的神经毒性与兴奋性氨基酸的过度释放密切相关,谷氨酸转运体有可能成为防治METH神经毒性的药物靶标。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-11
ABSTRACT  11-16
前言  16-22
材料与方法  22-35
  一、实验材料  22-23
  二、实验方法  23-35
实验结果  35-59
  一、甲基苯丙胺对大鼠行为学的影响  35-39
  二、头孢曲松抑制METH 致大鼠行为学改变的作用研究  39-42
  三、METH 亚急性处理对 GLT1 和 VGLUT1mRNA 的作用及头孢曲松对其影响  42-46
  四、METH 急性处理对谷氨酸转运体蛋白表达的影响及头孢曲松对其作用  46-48
  五、METH 亚急性处理对谷氨酸转运体蛋白表达的影响及头孢曲松对其作用  48-51
  六、METH 急性处理大鼠纹状体中神经递质含量的改变及头孢曲松对其影响  51-59
讨论  59-65
结论  65-66
参考文献  66-74
学术论文  74-84
个人简历  84-85
致谢  85

调控谷氨酸转运体对甲基苯丙胺致神经损伤的作用研究

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