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低剂量替米考星对离体恒化器模型中人肠道菌群的影响

作　者: 姚俊平
导　师: 袁宗辉
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 替米考星 人 肠道菌群 恒化器 药物残留 粪肠球菌 毒力 耐药
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


替米考星作为一种较新的大环内酯类畜禽专用抗生素在国内外已广泛使用,现行国内外ADI主要参考毒理学和微生物学NOAEL数据而制定。然而微生物学NOAEL的确定仅局限于对菌群中总厌氧菌群和总肠杆菌群数量以及总肠杆菌群的耐药比例变化的监测,低剂量替米考星长期作用于人体肠道菌群是否会产生其他负面影响目前尚缺乏资料考证,如优势细菌数量变化、菌群代谢的变化和定植屏障的破坏等。因此有必要进行更系统深入的研究低剂量替米考星对人肠道菌群的影响,从而为制定更合理的ADI提供参考数据。本研究采用接种了人粪便菌群的体外恒化模型来评估低剂量的替米考星对人肠道微生态的影响,从而评估现阶段我国替米考星ADI安全性。在模型达到稳态后分别连续7d添加终浓度为0、0.436μg/mL、4.36μg/mL、43.6μg/mL的替米考星,给药前和给药期间,监测短链脂肪酸浓度、优势细菌数量和兼性厌氧菌耐药率变化。采用一元线性回归的方法进行实验数据的比较与统计学分析,观测替米考星对恒化器模型中肠道菌群的影响；在给药停止三天后开始接种108CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌,1mL/d连续接种三天,采用培养计数的方法监测鼠伤寒沙门氏菌在不同给药浓度恒化器模型中的生长趋势,从而评估恒化器模型中人肠道菌群的屏障功能是否破坏。在替米考星给药剂量为43.6μg/mL恒化器模型中脆弱拟杆菌和肠球菌数量均呈现先减少后增加现象,而大肠杆菌和双歧杆菌数量波动范围扩大,分别由6.61×105-6.31×106 CFU/mL和1.02×106-1.23×107 CFU/mL扩大至3.02×105-1.62×107 CFU/mL和5.13×105-1.35×107 CFU/mL,菌群发生明显紊乱；在浓度为4.36μg/mL的试验中脆弱拟杆菌数量持续下降,下降幅度达370倍,而肠球菌数量出现先下降后上升趋势,大肠杆菌和双歧杆菌数量在给药期间均处于95%下线处波动；低剂量组恒化器模型(0.436μg/mL)中肠球菌和大肠杆菌数量未受到影响,双歧杆菌数量给药24h后出现短暂瞬时下降,而脆弱拟杆菌数量波动高于95%的置信上线。0.436、4.36和.43.6μg/mL浓度替米考星均未引起恒化器模型中大肠杆菌敏感性的显著变化；给药剂量为0.436和43.6μg/mL的恒化器模型中肠球菌敏感性显著下降,对16μg/mL替米考星耐药的细菌比例显著增加。四个不同给药浓度的恒化器模型中乙酸和丁酸的摩尔浓度均没有显著变化；丙酸摩尔浓度仅在高剂量组恒化器模型(43.6μg/mL)中出现瞬时短暂下降现象,而另外三个剂量组中丙酸浓度均未发现有显著性变化。通过含4μg/mL环丙沙星的选择平板进行鼠伤寒沙门氏菌计数,结果发现三组含替米考星的恒化器模型中鼠伤寒沙门氏菌数量与对照组比较无显著差异,即三种药物浓度作用后的恒化器模型中人肠道菌群屏障功能未被破坏。分别在12d、17d和20d从四个不同给药浓度恒化器模型中采集的样品分离粪肠球菌,检测其中可能存在的四种毒力基因esp、cylA、asa和gelE；然后采用微量肉汤稀释法检测携带毒力基因的粪肠球菌对替米考星、泰乐菌素和红霉素敏感性,同时检测是否存在耐药基因ermB;最后采用real-time PCR方法对各携带毒力基因的分离株进行毒力基因的相对定量,探讨毒力基因的表达与耐药之间的关系。结果发现分离得到的88株粪肠球菌中仅27株携带gelE基因,而其他毒力基因均未检测出；同时高剂量组恒化器模型中17d和20d分离的粪肠球菌表现三种大环内酯的交叉耐药,各分离菌株gelE基因相对定量结果显示高剂量组恒化器第20d分离的粪肠球菌gelE基因表达量相比给药前上升了200倍,而其他菌株gelE基因表达量变化无显著差异。综上所述,本研究设计的替米考星三个剂量组对恒化器模型人肠道菌群均有不同程度的影响,4.36μg/mL替米考星对人肠道菌群中脆弱拟杆菌数量产生显著抑制,同时0.436μg/mL替米考星对人肠道菌群中肠球菌耐药菌产生显著影响,说明不仅我国目前的ADI(40μg/kg体重)对人肠道菌群有一定的潜在危害,而且目前欧盟组织制定的ADI(4μg/kg体重)也可能对人肠道菌群产生影响,因此要求我们制定更低的替米考星ADI来保障人类的安全。另外,本研究发现高剂量药物作用下可能诱导耐药菌产生或增殖,且随着药物作用时间的延长诱导或增殖的耐药菌本身毒力基因表达可能会表现一定程度的上升。这提示我们在研究低剂量抗菌药物对人肠道菌群的影响,除了监测现有的因素以外,对于肠道菌群中条件致病菌毒力基因表达的变化的监测,有助于我们更全面、更深刻的了解抗菌药物对人肠道菌群的影响,从而做到更合理、更安全的使用抗菌药物。

全文目录


摘要  7-10
Abstract  10-13
缩略语表  13-15
1 前言  15-23
  1.1 立题依据  15-17
  1.2 国内外研究进展  17-21
    1.2.1 抗菌药物残留微生物学影响的评价方法  17-19
    1.2.2 肠球菌的大环内酯类耐药及其毒力  19-21
  1.3 研究内容和目标  21-23
    1.3.1 低剂量替米考星对离体恒化器模型中人肠道菌群的影响  21-22
    1.3.2 粪肠球菌耐药及毒力变化的研究  22-23
2 材料与方法  23-36
  2.1 抗菌药物及其配制  23
  2.2 试验菌株  23
  2.3 仪器设备  23-24
  2.4 培养基和试剂  24-26
    2.4.1 细菌计数用培养基和试剂  24-25
    2.4.2 短链脂肪酸标准品和试剂  25-26
    2.4.3 肠道菌群培养用培养基  26
    2.4.4 PCR及real-time PCR试剂  26
  2.5 肠道菌群培养基对替米考星活性影响的检测  26-27
    2.5.1 替米考星与肠道菌群培养基的孵育  26
    2.5.2 含药纸片的制作及替米考星活性的检测  26-27
  2.6 人肠道菌群恒化器模型的运行  27-28
    2.6.1 灭菌前准备  27
    2.6.2 灭菌处理  27
    2.6.3 预还原处理  27
    2.6.4 健康人粪便菌悬液的接种及培养  27-28
  2.7 替米考星剂量的确定及给药  28-29
  2.8 恒化器模型中菌液的采集及分析  29-31
    2.8.1 菌液样品的采集  29
    2.8.2 优势细菌培养计数  29
    2.8.3 短链脂肪酸的检测  29-30
    2.8.4 肠球菌和大肠杆菌替米考星敏感性的检测  30-31
  2.9 定植抗力破坏的检测  31
    2.9.1 接种物的制备及接种  31
    2.9.2 鼠伤寒沙门氏菌定植的判定  31
  2.10 恒化器模型中粪肠球菌的耐药性与毒力基因表达的变化  31-35
    2.10.1 粪肠球菌的分离鉴定  31-32
    2.10.2 粪肠球菌分离株各毒力基因的鉴定  32-33
    2.10.3 粪肠球菌分离株敏感性试验及其大环内酯耐药基因PCR  33
    2.10.4 细菌总RNA提取  33
    2.10.5 总RNA的反转录  33-34
    2.10.6 16S rRNA基因PCR检测DNA污染及反转录的成功  34
    2.10.7 粪肠球菌明胶酶毒力基因的相对定量real-time PCR  34-35
  2.11 数据处理及分析  35-36
3 结果  36-53
  3.1 肠道菌群培养基对替米考星活性的影响  36
  3.2 低剂量替米考星对恒化器模型中人肠道菌群的影响  36-45
    3.2.1 替米考星对离体恒化器模型中优势菌群数量的影响  36-39
    3.2.2 替米考星对离体恒化器模型中短链脂肪酸的影响  39-41
    3.2.3 替米考星对肠道中兼性厌氧菌耐药性的影响  41-44
    3.2.4 替米考星对人体肠道菌群定植抗力的影响  44-45
  3.3 恒化器模型中粪肠球菌分离株毒力与耐药关系的分析  45-53
    3.3.1 粪肠球菌分离鉴定及毒力基因的检测  45-48
    3.3.2 含毒力基因粪肠球菌菌株药敏试验及耐药基因ermB的检测  48-49
    3.3.3 粪肠球菌总RNA的提取与质量  49-50
    3.3.4 总RNA中DNA污染的去除及cDNA的合成  50
    3.3.5 粪肠球菌明胶酶毒力基因(gelE)的相对定量real-time PCR  50-53
4 讨论  53-59
  4.1 替米考星对恒化器模型中人肠道菌群的影响  53-57
    4.1.1 对优势细菌数量的影响  53-54
    4.1.2 短链脂肪酸变化  54-55
    4.1.3 大肠杆菌和肠球菌耐药率变化  55-56
    4.1.4 恒化器模型中人肠道菌群定植屏障破坏的检测  56-57
  4.2 恒化器模型中分离的粪肠球菌毒力与耐药的关系  57-59
5 小结  59-60
文献综述  60-73
参考文献  73-83
致谢  83-84
附录  84-92

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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