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枯草芽胞杆菌TR21的发酵和海洋细菌DM09的抗真菌活性物质研究

作　者: 刘学明
导　师: 喻子牛；张吉斌
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 香蕉枯萎病田口稳健设计伊枯草菌素 Bacillus velezensis
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本论文共包括两部分工作：一部分是对抗香蕉枯萎病4号小种的枯草芽胞杆菌TR21进行了发酵条件优化及田间防效的测定；另一部分是对分离自深海的广谱抗真菌芽胞杆菌进行了快速分子鉴定,并对其产生的抗真菌物质进行了分离鉴定。1.香蕉枯萎病是引起维管束坏死的一种毁灭性真菌病害和典型的土传病害,严重影响我国香蕉生产。分离自石斛兰叶片的枯草芽胞杆菌TR21对香蕉枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f. sp. Cubense有很好的拮抗效果。研究发现该菌的防效和芽胞数成正相关,提高芽胞数可以提高经济效益并降低成本。本研究对TR21的产芽胞培养基进行了优化,并对TR21的田间防效进行了测定。结果如下：首先确定筛选培养基：玉米粉10g/L,豆粕粉9g/L。然后对适合TR21产芽胞的碳源、氮源和无机盐进行了筛选,得到了基础配方：玉米粉10g/L,豆粕粉9g/L,KH2PO43g/L。初始pH7.5。然后运用田口稳健设计方法对基础培养基各营养物的浓度及碳氮源搭配进行了优化,主要选择五个因素：初始pH,碳源总量,氮源总量,玉米粉浓度,豆粕粉浓度,KH2PO4。经过信噪比优化得出了优化条件：初始pH7.0,玉米粉8g/L,葡萄糖12g/L,豆粕粉16g/L,氯化铵4g/L,磷酸二氢钾2g/L,芽胞产量达到19.6x108cfu/mL,比未优化的过程(7.0×108)提高了2.8倍。在珠海对TR21的田间防效进行了测定：处理组发病率明显低于对照组发病率,TR21的田间防效可以达到66.95%。2.核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary]是一种世界性分布的重要植物病原真菌,在我国严重威胁油菜生产。生物防治控制核盘菌是目前菌核病防治研究的重点方向。我们分离到一株对核盘菌有显著拮抗作用的来自深海的芽胞杆菌DM09,对其进行了分类研究,对其拮抗活性物质进行了分离纯化,结果如下：首先通过16S rDNA序列分析,分析其属于芽胞杆菌属,但不能准确鉴定到种；利用gyrB基因blast结果构建系统发育树,最终将该菌株确定为B. velezensis。结果显示利用16S rDNA和gyrB基因组合可以快速准确的鉴定枯草芽胞杆菌组内的近缘种。然后以核盘菌为指示菌,首先通过酸沉淀实验、两步超滤实验推断出活性物质是脂肽类物质。随后用酸沉淀、两步超滤、固相萃取、液相色谱的方法纯化了脂肽类物质。经过ESI-MS串联质谱鉴定,活性物质分子量为1043.7Da和1057.7Da,两种活性物质的一级结构均为Pro-Asn-Tyr-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln(βAA为14个和15个碳原子的氨基脂肪酸),属脂肽类抗生素伊枯草菌素及其同系物。这也是首次在B.velezensis中发现伊枯草菌素。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一部分抗香蕉枯萎病4号小种枯草芽胞杆菌TR21的发酵条件优化及田间防效测定  11-31
  1 前言  11-16
    1.1 香蕉枯萎病危害概况  11-12
    1.2 国内外香蕉枯萎病生物防治概况  12-14
    1.3 培养基配方优化方法概况  14-16
  2 材料和方法  16-20
    2.1 实验材料  16-17
      2.1.1 菌株和培养基  16
      2.1.2 实验仪器  16-17
    2.2 实验方法  17-20
      2.2.1 TR21的形态学观察  17
      2.2.2 TR21的活化  17
      2.2.3 碳源筛选实验  17
      2.2.4 氮源筛选实验  17
      2.2.5 无机盐筛选实验  17-18
      2.2.6 田口稳健设计方法优化TR21的发酵培养基  18-19
      2.2.7 枯草芽胞杆菌TR21对香蕉枯萎病的田间防效测定  19-20
  3 结果和分析  20-30
    3.1 TR21的形态学观察  20-21
    3.2 碳源筛选结果  21-22
    3.3 氮源筛选结果  22-23
    3.4 无机盐筛选实验  23
    3.5 田口设计优化TR21的发酵培养基  23-28
      3.5.1 田口设计实验和结果  23-25
      3.5.2 信噪比和均值方差分析  25-27
      3.5.3 参数主效应图  27-28
      3.5.4 优化结果  28
    3.6 TR21防治巴西蕉枯萎病的田间试验  28-30
  4 讨论  30-31
第二部分抗油菜核盘菌海洋细菌的快速分子鉴定和抗菌活性物质研究  31-51
  1 前言  31-36
    1.1 油菜核盘菌危害及生物防治概况  31-32
    1.2 海洋细菌活性物质研究概况  32-34
    1.3 解淀粉芽胞杆菌生物防治研究概况  34-36
  2 材料和方法  36-41
    2.1 实验材料  36-37
      2.1.1 供试菌株  36
      2.1.2 实验药品  36
      2.1.3 培养基  36-37
      2.1.4 实验仪器  37
    2.2 实验方法  37-41
      2.2.1 菌株DM09的16S rDNA序列扩增  37-39
      2.2.2 菌株DM09的gyrB基因序列扩增  39
      2.2.3 序列的系统发育进化分析  39
      2.2.4 活性物质特性研究  39-40
        2.2.4.1 活性物质分子量大小确定  39
        2.2.4.2 酸沉淀实验  39
        2.2.4.3 甲醇对X-01菌株拮抗物质聚集特性的影响  39-40
      2.2.5 脂肽的分离纯化和结构鉴定  40-41
        2.2.5.1 酸沉淀  40
        2.2.5.2 50 kD两步超滤  40
        2.2.5.3 固相萃取  40
        2.2.5.4 高效液相色谱分离  40
        2.2.5.5 电喷雾质谱鉴定脂肽结构  40-41
  3 结果和分析  41-49
    3.1 16S rDNA和gyrB基因序列的克隆  41-42
    3.2 基于16S rDNA基因的BLAST结果  42-43
    3.3 基于gyrB基因Blast结果的系统进化分析  43
    3.4 活性物质特性研究  43-44
      3.4.1 活性物质分子量大小确定  43-44
      3.4.2 酸沉淀实验  44
      3.4.3 甲醇对活性物质聚集特性影响  44
    3.5 脂肽分离纯化和结构鉴定  44-49
      3.5.1 固相萃取  44-45
      3.5.2 高效液相色谱  45-46
      3.5.3 电喷雾质谱鉴定脂肽结构  46-49
  4 讨论  49-51
参考文献  51-58
致谢  58

枯草芽胞杆菌TR21的发酵和海洋细菌DM09的抗真菌活性物质研究

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