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农杆菌介导的P5CS基因转化东农303马铃薯的研究

作　者: 高亚迪
导　师: 李葵花
学　校: 东北林业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 马铃薯 抗逆性 渗透胁迫 P5CS基因
分类号: S532
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


干旱、盐碱、高温、低温等环境条件是影响植物生长发育的重要因素,这些非生物因素通过渗透胁迫(osmotic stress)影响植物细胞膨压从而导致植物的不良生长。在渗透胁迫下,植物将产生一些渗透调节物质抵抗该胁迫,包括脯氨酸和甜菜碱。脯氨酸主要来源于谷氨酸合成途径,△1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)是脯氨酸合成的关键酶。为了提高我国马铃薯栽培品种对环境胁迫的适应能力,本论文实施了来自拟南芥的P5CS基因转化我国马铃薯栽培品种东农303的研究。首先通过不同植物生长调节剂组合的试验,优化了东农303马铃薯品种的高效再分化体系；其次采用农杆菌介导法将P5CS基因转化到马铃薯基因组中,并通过PCR、PCR片段BLAST、Southern blot检测,验证了目的基因已转入到马铃薯基因组中。另外,探讨了转基因植株在干旱和盐胁迫条件下的生长势和生理生化变化。1、分别利用马铃薯脱毒试管苗和薯块为试验材料,通过吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、玉米素(ZT)、潮霉素(Hy)的不同组合优化了遗传转化体系。结果表明,最适再分化培养基为MS+ZT 3.5mg/L+IAA l.Omg/L,再分化条件中最适潮霉素筛选压力为6mg／L；最适生根培养基为1／2 MS培养基,生根潮霉素筛选压力为10mg／L。2、对潮霉素抗性株系进行了分子生物学检测。利用特异性引物进行了P5CS基因的特异性PCR扩增,获得了一条701bp的所需目的条带；将所获得的目的条带进行连接、转化、测序、BLAST比对,发现目的条带与拟南芥P5CS基因同源性为100%；分别用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化抗性株系和未转化株系的总DNA,通过进一步的Southern杂交实验,抗性株系获得一条阳性条带,推测P5CS基因在马铃薯基因组中有一个拷贝,最终获得了一个转基因株系。3、探讨了转基因株系在1.5% NaCl盐和60%、40%、20%干旱胁迫下的植株的生长势和生理生化变化。结果表明,转基因株系在叶片伸展度、根系的发达程度以及在结薯量上均优于非转基因株系。生理生化方面,转基因植株在盐胁迫时产生脯氨酸的含量比未处理时增加了25倍,是未转基因植株的1.7倍,MDA含量的增加仅为未转基因植株的0.4倍,SOD活性则是未转基因植株的2.6倍；在60%、40%、20%的干旱胁迫程度下,转基因植株脯氨酸含量分别是未转基因植株的1.2倍、1.4倍和2.1倍,转基因植株丙二醛含量的增加均是未转基因植株的0.6倍,转基因植株SOD活性分别为未转基因植株的2.5倍、2.8倍和5.6倍。以上试验结果表明转P5CS基因马铃薯的抗旱和耐盐性均得到了提高。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
1 绪论  10-16
  1.1 引言  10
  1.2 抗渗透胁迫植物的研究进展  10-15
    1.2.1 渗透胁迫与渗透调节  10-11
    1.2.2 渗透调节相关物质  11-13
    1.2.3 P5CS简介  13
    1.2.4 转P5CS基因抗性植物的研究进展  13-14
    1.2.5 植物抗渗透胁迫中的其他生理生化变化  14-15
  1.3 研究目的和意义  15-16
2 马铃薯东农303品种的遗传转化  16-24
  2.1 试验材料、试剂与仪器  16-18
    2.1.1 材料  16
    2.1.2 试剂  16
    2.1.3 仪器  16
    2.1.4 培养基  16-17
    2.1.5 质粒和菌株  17-18
  2.2 试验方法  18-19
    2.2.1 马铃薯薯块再分化体系的优化  18
    2.2.2 最适生根诱导培养基的筛选  18-19
    2.2.3 农杆菌侵染、共培养及脱菌  19
    2.2.4 再分化和生根过程中潮霉素选择压力的确定  19
  2.3 结果与分析  19-22
    2.3.1 马铃薯微型薯再分化  19-20
    2.3.2 生根培养基的筛选  20-21
    2.3.3 再分化和生根过程中潮霉素的选择压力  21-22
  2.4 讨论  22
    2.4.1 关于试验材料的选择  22
    2.4.2 共培养时间、农杆菌侵染时间和OD_(600)的选择  22
    2.4.3 关于脱菌过程中羧苄浓度的选择  22
  2.5 本章小结  22-24
3 转化植株的检测  24-34
  3.1 材料、试剂及仪器  24-25
    3.1.1 材料  24
    3.1.2 试剂  24
    3.1.3 仪器  24
    3.1.4 引物  24-25
  3.2 试验方法  25-29
    3.2.1 植物总DNA的提取(CTAB法)  25
    3.2.2 质粒DNA提取(试剂盒法)  25-26
    3.2.3 目的基因的PCR检测  26
    3.2.4 PCR产物的纯化  26-27
    3.2.5 目的片段与载体的连接  27
    3.2.6 连接产物的转化  27
    3.2.7 筛选阳性克隆  27-28
    3.2.8 目的基因片段的测序与BLAST分析  28
    3.2.9 Southern杂交  28-29
  3.3 结果与分析  29-33
    3.3.1 待检测植株的DNA提取  29-30
    3.3.2 质粒DNA的提取  30
    3.3.3 PCR检测  30-31
    3.3.4 目的基因片段的BLAST分析  31
    3.3.5 Southern杂交结果  31-33
  3.4 本章小结  33-34
4 转化植株的抗旱和耐盐性检测  34-45
  4.1 材料、试剂与仪器  34
    4.1.1 材料  34
    4.1.2 试剂  34
    4.1.3 仪器  34
  4.2 试验方法  34-37
    4.2.1 干旱和盐处理  34
    4.2.2 各种生理指标测试  34-37
    4.2.3 根系与结薯状况  37
  4.3 结果与分析  37-44
    4.3.1 干旱和盐胁迫对植株生长势的影响  37-38
    4.3.2 生理生化指标测定  38-43
    4.3.3 根系与结薯  43-44
  4.4 讨论  44
  4.5 本章小结  44-45
结论  45-46
参考文献  46-50
附录  50-51
攻读学位期间发表的学术论文  51-52
致谢  52-53

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 薯类作物 > 马铃薯（土豆）
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