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魏氏梭菌α毒素基因的克隆表达及间接ELISA方法的初步研究

作　者: 宋宇
导　师: 黄勇
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 魏氏梭菌 α毒素原核表达 PET-32a(+) 重组蛋白间接ELISA
分类号: S858.291
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

魏氏梭菌病是危害养兔业的重要疾病。某养兔场发生一种以急性黑色水样腹泻或排带血的胶冻样粪便、盲肠出血、胃黏膜出血为主要特征的传染病。通过病原菌的分离培养、形态染色观察、生化鉴定和半套式PCR反应,分离出一株魏氏梭菌。通过药物敏感实验筛选出了敏感药物。实验结果为该病的正确防控措施的制定提供了参考。对GenBank发表的魏氏梭菌α毒素基因的氨基酸序列进行了二级结构、疏水性、抗原决定簇、跨膜区以及抗原性分析,在此基础上,对α毒素基因130～966 nt位的837 bp长的适合原核表达的区域进行PCR扩增、克隆、核酸序列测定和生物信息学分析。序列测定结果表明：该段序列全长837 bp。核酸序列同源性分析表明：该序列与GenBank中的其他魏氏梭菌菌株的α毒素基因同源性高达99%。生物信息学分析表明：该基因编码的蛋白具有亲水性,没有跨膜区,共有11个抗原决定簇,在整个序列存在较强的抗原性。然后将目的片段正确插入原核表达载体PET-32a(+)的EcoRⅠ和Hind III位点间,成功构建了重组表达质粒PET-32a (+)-a,重组表达质粒PET-32a(+)-α转化表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达出大小为53KD的重组蛋白。对重组蛋白进行了可溶性与不可溶性分析,结果表明表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在。同时对诱导温度、诱导时间及IPTG浓度进行了优化,确定了最佳表达条件。以纯化的重组蛋白为包被抗原(重组蛋白量为0.241mg／ml,A260=0.340),建立了检测魏氏梭菌α毒素抗体的间接ELISA方法；结果表明：当OD450≥0.30时即判定为阳性,当OD450<0.30时即判定为阴性。该方法可用于抗魏氏梭菌α毒素抗体的检测。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第一部分文献综述及选题的目的意义  8-16
  1. 魏氏梭菌研究概况  8-9
  2. α毒素的研究进展  9-13
    2.1 α毒素基因的理化性质和生物学特性  9-10
    2.2 α毒素的克隆和序列分析  10-11
    2.3 α毒素基因的表达和调控  11-12
    2.4 α毒素基因的结构和功能  12-13
  3. α毒素和致病性的关系研究进展  13-14
  4. 抗α毒素抗体和免疫力的关系研究进展  14
  5. 检测α毒素抗体方法的研究进展  14-15
  6. 本实验的目的及意义  15-16
第二部分试验研究  16-58
  第一章家兔魏氏梭菌的分离与鉴定  16-24
    1 材料  16-17
    2 方法  17-19
    3 结果与分析  19-21
    4 讨论  21-23
    5 小结  23-24
  第二章魏氏梭菌α毒素基因的克隆及生物信息学分析  24-34
    1 材料  24-25
    2 方法  25-28
    3 结果与分析  28-32
    4 讨论  32-33
    5 小结  33-34
  第三章魏氏梭菌α毒素基因的原核表达  34-48
    1 材料  34-35
    2 方法  35-39
    3 结果与分析  39-43
    4 讨论  43-47
    5 小结  47-48
  第四章检测魏氏梭菌α毒素抗体的间接ELISA方法的建立  48-58
    1 材料  48-49
    2 方法  49-52
    3 结果与分析  52-56
    4 讨论  56-57
    5 小结  57-58
第三部分参考文献  58-63
附录  63-64
致谢  64

魏氏梭菌α毒素基因的克隆表达及间接ELISA方法的初步研究

内容摘要

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