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应用新城疫病毒反向遗传操作系统—构建L表达质粒

作　者: 郭清华
导　师: 栗淑媛
学　校: 内蒙古师范大学
专　业: 植物学
关键词: 反向遗传操作系统新城疫病毒 L基因表达质粒长链RT-PCR
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

反向遗传操作系统(reverse genetic system, RGS)就是获得病毒的基因组序列后,借助于载体构建病毒的全长cDNA分子克隆,同时将RNA聚合酶的启动子元件导入到此分子克隆中,经体外转录合成病毒RNA,进一步去侵染宿主或敏感细胞系,增殖出大量的与原病毒相似的活病毒,与之相关的研究技术称为反向遗传学技术(Reverse genetics manipulation technique),也被称为病毒拯救(Rescue of virus)。该技术为研究病毒蛋白功能、基因作用元件提供了方法,也使负链RNA病毒可作为载体表达外源基因。新城疫是由新城疫病毒引起的禽类急性传染病。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)新城疫样病毒属(Avulavirus)。新城疫病毒是不节段的负链RNA动物病毒,按其致病性的强弱新城疫病毒可分为三类:高致病性(强毒株)、中致病性(中毒株)和低致病性(弱毒株)。NDV LaSota株属于低致病性的弱毒株,多用作保护禽类的活疫苗。将NDV LaSota作为疫苗载体,有许多优势,如:可稳定表达外源基因,其与同源的RNA病毒不发生重组;安全稳定,成本低廉;弱毒株对人和动物无致病性;免疫接种途径简单;能够诱导机体产生良好的体液免疫、黏膜免疫及局部免疫等。将NDV LaSota作为疫苗载体有很大的应用前景,因而引起研究者更多的关注。构建含有新城疫病毒全基因组的cDNA分子克隆和含有RNA复制酶及核蛋白的编码序列的辅助质粒,共同转染宿主细胞,从而建立新城疫病毒的反向遗传操作系统,从而实现新城疫病毒的拯救。在新城疫病毒基因组编码的六种蛋白中,L蛋白是病毒RNA聚合酶,与P蛋白形成具有完整聚合酶活性的复合物。P蛋白、NP蛋白和L蛋白与病毒基因组结合形成核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein complex, RNP)是启动NDV的复制、转录和翻译所必需的。所以构建编码L蛋白的基因的表达质粒是建立NDV反向遗传操作系统的基础。本试验通过在vero细胞中增殖病毒,用Trizol提取病毒RNA,应用长链RT-PCR法一次性扩增出约6.6kb的L基因,进一步将其与T-vecter相连亚克隆后,再与真核表达载体pcDNA3.1(+)相连,从而构建编码L蛋白的基因的表达质粒。经RT-PCR、免疫组化检测和限制性内切酶酶切鉴定以及基因测序认定L基因在BHK细胞中成功表达,L质粒构建成功。本研究为建立NDV的反向遗传操作系统奠定了基础,同时对长链RT-PCR法的条件优化和简化克隆的构建提供了参考。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一章引言  10-18
  1 反向遗传操作系统概况  10-13
  2 新城疫病毒概况  13-16
  3 应用反向遗传操作技术构建重组NDV 疫苗载体  16-17
  4 本课题拟解决的问题及意义  17
  5 本课题的研究技术路线  17-18
第二章扩增L 基因全长CDNA  18-34
  1 实验材料  18-20
  2 实验方法  20-29
  3 实验结果  29-31
  4 讨论  31-34
第三章 L 真核表达质粒的构建及表达  34-44
  1 实验材料  34-35
  2 实验方法  35-40
  3 实验结果  40-43
  4 讨论  43-44
结论  44-45
参考文献  45-48
附录1 缩略词中英文对照  48-49
附录2 质粒图谱  49-51
附录 3 公司测序结果与 GENEBank 中的序列对比  51-62
致谢  62-63
攻读学位期间发表的学术论文  63

应用新城疫病毒反向遗传操作系统—构建L表达质粒

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