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干细胞在PET上的三维扩增培养

作　者: 曹延粉
导　师: 王菊芳
学　校: 华南理工大学
专　业: 发酵工程
关键词: 骨髓间充质干细胞胚胎干细胞 PET纤维材料三维扩增培养
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

骨髓间充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能,可在体外大量扩增,并且具有调节细胞免疫反应的功能,其来源不存在伦理争议问题。因此是细胞治疗和组织工程中理想的种子细胞来源。胚胎干细胞(ESCs)可作为药物筛选的理想资源。而现今面临的主要问题是如何获得大量优质的种子干细胞来满足其在医学上的应用,现今的技术手段仍无法解决干细胞的大规模扩增问题,因此需要研究和发展干细胞的三维培养平台技术。针刺无纺聚对苯二甲酸乙二酯(Polyethylene Terephthalate,PET)纤维材料可作为三维的支架材料来支持MSCs和ESCs的增殖,它具备高孔隙率、比表面积大、渗透性好、机械强度高的优点,其独特的三维结构可提供给细胞一个仿生的环境。研究目的:本实验采用PET纤维材料对hMSCs和mESCs进行三维扩增培养,探讨并优化hMSCs的培养条件及评定三维扩增的效果。为将来研发大规模生产干细胞的系统,进而建立一个相对成熟高效的培养系统平台做基础实验方法:为了优化hMSCs在PET上的条件培养,CCK-8法检测了bFGF对hMSCs的增殖影响,分析了在PET纤维材料上的接种密度对细胞增殖的影响,检测了乳酸对细胞增殖的抑制作用;进一步探讨了hMSCs在PET上的增殖和代谢的特点;利用Cell tracker Green荧光染色,激光共聚焦显微镜检测细胞在材料上的活性;扫描电镜检测细胞在PET上的分布、形态及粘附情况;检测了低浓度的bFGF对PET上细胞的影响;流式细胞仪鉴定三维扩增后的hMSCs的表面标记物CD29、CD44、CD34和CD45。对hMSCs进行向成骨、成脂方向的诱导培养;最后通过倒置显微镜观察、接种量的优化和激光共聚焦显微镜、扫描电镜的观察检测PET对mESs的扩增培养情况。结果:实验研究表明,培养基中5 ng/mL的bFGF,每孔接种1×104个hMSCs及保持培养基中的乳酸浓度少于0.9 g/L有利于促进PET上hMSCs的增殖。PET能够支持更长期的细胞的培养,而且PET上培养的hMSCs的对营养物的利用率更高。观察显示hMSCs及mESCs在PET纤维材料上成立体,多层生长,有较大的生长空间。三维扩增后的细胞保持了原有未分化状态和分化潜能;bFGF对三维材料上hMSCs的增殖有更明显的促进作用。1~2×104个细胞/孔为mESCs在PET纤维材料上接种的最适密度。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章绪论  14-28
  1.1 干细胞  14-15
    1.1.1 骨髓间充质干细胞  14-15
    1.1.2 胚胎干细胞  15
  1.2 干细胞在医学中的应用  15-19
    1.2.1 细胞治疗  16-17
    1.2.2 基因治疗  17
    1.2.3 组织工程  17-18
    1.2.4 新药开发  18
    1.2.5 MSCs 作用机制  18-19
  1.3 干细胞的三维扩增培养  19-23
    1.3.1 三维扩增方式  20-21
    1.3.2 三维扩增系统  21-23
  1.4 三维培养的影响因素  23-26
    1.4.1 培养基及添加物  23-24
    1.4.2 接种密度  24
    1.4.3 搅拌速率  24-25
    1.4.4 无血清培养  25
    1.4.5 氧分压  25-26
  1.5 本研究意义和内容  26-28
    1.5.1 研究意义  26-27
    1.5.2 研究内容  27-28
第二章 hMSCs 培养条件的优化  28-37
  2.1 实验材料  28-29
    2.1.1 材料和细胞  28
    2.1.2 主要药品与试剂  28-29
    2.1.3 实验设备和材料  29
  2.2 实验方法  29-32
    2.2.1 实验用主要溶液的配制  29-30
    2.2.2 实验器皿的无菌处理  30
    2.2.3 细胞复苏  30-31
    2.2.4 PET 处理  31
    2.2.5 细胞接种  31
    2.2.6 bFGF 对细胞的增殖的影响  31-32
    2.2.7 接种量对PET 上hMSCs 的影响  32
    2.2.8 乳酸对细胞的影响  32
  2.3 实验结果与讨论  32-36
    2.3.1 细胞形态观察  32-33
    2.3.2 bFGF 对细胞增殖的影响  33-34
    2.3.3 接种量对细胞的影响  34-35
    2.3.4 乳酸对细胞增殖的影响  35-36
  2.4 小结  36-37
第三章 hMSCs 的三维扩增培养  37-48
  3.1 实验材料  37-38
    3.1.1 材料和细胞  37
    3.1.2 主要药品与试剂  37
    3.1.3 实验设备与材料  37-38
  3.2 实验方法  38-40
    3.2.1 溶液的配制  38
    3.2.2 细胞的接种  38-39
    3.2.3 细胞的增殖及代谢的测定  39
    3.2.4 激光共聚焦显微镜检测  39-40
    3.2.5 扫描电镜检测  40
  3.3 实验结果和讨论  40-46
    3.3.1 hMSCs 的三维培养结果分析  40-43
    3.3.2 细胞生长状态的观察  43-46
    3.3.3 bFGF 对PET 纤维材料上hMSCs 影响:  46
  3.4 小结  46-48
第四章 hMSCs 扩增后的鉴定与分化  48-59
  4.1 实验材料  48-49
    4.1.1 实验药品和试剂  48-49
    4.1.2 实验设备和材料  49
  4.2 实验方法  49-52
    4.2.1 实验用主要溶液的配制  49-50
    4.2.2 流式细胞仪检测hMSCs 的表面标记物  50-51
    4.2.3 骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导  51
    4.2.4 骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导  51-52
  4.3 实验结果和讨论  52-57
    4.3.1 细胞表面标记的鉴定  52-55
    4.3.2 细胞的分化  55-57
  4.4 小结  57-59
第五章 PET 用于鼠胚胎干细胞的扩增培养  59-67
  5.1 实验材料  59-60
    5.1.1 材料和细胞  59
    5.1.2 主要药品与试剂  59
    5.1.3 实验设备和材料  59-60
  5.2 实验方法  60-62
    5.2.1 实验用主要溶液的配制  60
    5.2.2 m SCs 的二维培养体系  60-61
    5.2.3 细胞的接种密度对细胞的影响  61
    5.2.4 激光共聚焦显微镜检测  61
    5.2.5 扫描电镜观察  61-62
  5.3 实验结果和讨论  62-66
    5.3.1 倒置显微镜观察  62
    5.3.2 接种量对细胞的影响  62-64
    5.3.3 m ESCs 在PET 上生长状态的观察  64-66
  5.4 小结  66-67
结论和展望  67-69
参考文献  69-75
攻读硕士学位期间取得的研究成果  75-76
致谢  76

干细胞在PET上的三维扩增培养

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