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健康人群携带沙门氏菌第一类整合子与基因组岛的鉴定及特性分析

作　者: 常彦磊
导　师: 石磊
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 整合子系统耐药基因盒沙门氏菌水平传播
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目前,细菌的耐药性已经是世界关注的问题。细菌感染的发生率及其病原菌的耐药率一直居高不下,对人类的健康造成了很大的威胁。整合子-耐药基因盒系统作为病原菌主要的耐药机制之一,近年来已成为研究人员关注的热点,本研究将分析健康人群携带的沙门氏菌中第一类整合子及沙门氏菌基因组岛(SGI1)在的分布及特性,分析其与细菌耐药性的关系。将按照临床实验室标准化委员会(CLSI)的规定,用纸片扩散法药敏试验检测58株健康人携带的沙门氏菌对15种抗生素的敏感性。将通过聚合酶链反应(PCR)检测Ⅰ类整合酶基因(intI1),阳性者扩增耐药基因盒,并对阳性扩增产物进行测序,所得序列应用Standard nucleotide nucleotic BLAST在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov )上比对并进行序列分析。应用滤膜法质粒接合转移试验对第一类整合子进行定位分析,并检测其可移动性。应用Sau-PCR方法对菌株进行分子分型,所得条带用Quantity One软件进行分析,绘制树状图。同时对第一类整合子阳性菌株检测沙门氏菌基因组岛(SGI1),分别检测其左侧、右侧部分及其中间的部分基因,阳性扩增产物进行测序及序列比对,对SGI1染色体外环状形式及切除进行检测,通过接合转移及自然转化试验检测其可移动性。研究结果表明:1、从健康人分离出的沙门氏菌耐药性较低,第一类整合子检出率不高,可能是由于面临较小的抗生素压力。07年与05年相比,耐药性及第一类整合子的检出率均有增高趋势。相关从业人员接触抗生素的机会不多,因此很可能是食品中细菌携带的整合子通过食物链播散给人。其携带的耐药基因盒与耐药表型相符,且可转移至其他细菌,介导细菌耐药的水平传播。第一类整合子阳性和阴性菌株的基因型无直接关联。2、首次阐述了从健康人分离的沙门氏菌携带SGI1这一现象,且SGI1可通过自然转化方式转移到其他菌株,介导多重耐药的传播。总之,健康人群中分离的沙门氏菌携带有第一类整合子及SGI1,且可以进行转移,这些菌株不仅可长期在人体内生存,且可以不断向外界进行排菌,与耐药性的广泛传播密切相关,一旦条件适合还有可能引起耐药菌株的暴发流行,因此我们应从基因水平全面监测细菌耐药情况,研究可能的耐药机制,从而为制定相应预防策略提供理论依据。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-14
第一章绪论  14-26
  1.1 抗生素的耐药机制  14-16
    1.1.1 细菌耐药的生化机制  14-15
    1.1.2 细菌耐药的遗传学机制  15-16
  1.2 耐药基因的水平传播途径  16-20
    1.2.1 耐药性质粒传递  16-17
    1.2.2 转座子介导的耐药性  17
    1.2.3 整合子系统介导的耐药性  17-20
  1.3 沙门氏菌基因组岛与耐药性  20-22
    1.3.1 沙门氏菌多重耐药表现型在全球范围出现的历史  20-21
    1.3.2 SGI1 的迁移性  21-22
  1.4 抗生素耐药性由动物向人类的传播与扩散  22-24
    1.4.1 动物源性耐药菌对食品和环境的污染  22
    1.4.2 动物源性细菌耐药性向人体的传播  22-24
  1.5 本课题的研究意义及主要内容  24-26
第二章健康人群携带的沙门氏菌中耐药表型分析及整合子系统基因检测与分析  26-42
  2.1 引言  26-27
  2.2 实验材料与设备  27-31
    2.2.1 主要仪器设备  27
    2.2.2 主要试剂和耗品  27-28
    2.2.3 实验菌株  28-30
    2.2.4 培养基和常用溶液配制  30-31
  2.3 实验方法  31-36
    2.3.1 药敏实验(K-B 法)  31
    2.3.2 第一类整合酶基因 intI1 的扩增  31-32
    2.3.3 琼脂糖凝胶电泳  32-33
    2.3.4 第一类整合子携带耐药基因盒扩增  33
    2.3.5 耐药基因盒扩增产物的凝胶电泳  33
    2.3.6 扩增片段序列分析  33-36
  2.4 实验结果与讨论  36-41
    2.4.1 药敏实验  36-37
    2.4.2 第一类整合酶基因 intI1 的扩增  37-38
    2.4.3 第一类整合子携带耐药基因盒扩增和序列解析  38-41
  2.5 本章小结  41-42
第三章健康人群携带沙门氏菌基因指纹图谱分析  42-54
  3.1 引言  42-43
  3.2 实验材料与设备  43-45
    3.2.1 主要仪器设备  43
    3.2.2 主要试剂和耗品  43
    3.2.3 培养基及常规试剂配制  43-45
    3.2.4 实验菌株  45
  3.3 实验过程与方法  45-50
    3.3.1 Sau-PCR 反应原理  45-46
    3.3.2 Sau-PCR 基因分型技术的建立  46-49
    3.3.3 Sau-PCR 扩增反应  49-50
  3.4 实验结果和讨论  50-52
    3.4.1 引物的筛选  50-51
    3.4.2 健康人群携带的沙门氏菌同源性分析  51-52
  3.5 本章小结  52-54
第四章健康人群携带沙门氏菌第一类整合子定位分析  54-59
  4.1 引言  54
  4.2 主要仪器和设备  54-56
    4.2.1 主要仪器设备  54
    4.2.2 主要试剂和耗品  54-55
    4.2.3 实验菌株和质粒  55
    4.2.4 培养基及常规试剂配制  55-56
  4.3 实验方法  56-57
    4.3.1 接合转移  56-57
    4.3.2 质粒 DNA 提取  57
  4.4 结果与讨论  57-58
  4.5 本章小结  58-59
第五章健康人携带的沙门氏菌中沙门氏菌基因组岛的鉴定及特性分析  59-71
  5.1 引言  59
  5.2 实验主要仪器和设备  59-62
    5.2.1 主要仪器设备  59-60
    5.2.2 主要试剂和耗品  60
    5.2.3 实验菌株和质粒  60-61
    5.2.4 培养基及常规试剂配制  61-62
  5.3 实验方法  62-66
    5.3.1 SGI1 及其变异型的检测  62-64
    5.3.2 可移动性检测  64-66
  5.4 实验结果与分析  66-70
    5.4.1 SGI1 的检测  66-67
    5.4.2 SGI1 切除的检测  67
    5.4.3 质粒结合转移  67
    5.4.4 自然基因转化  67-70
  5.5 本章小结  70-71
结论与展望  71-72
参考文献  72-78
攻读硕士学位期间取得的研究成果  78-79
致谢  79

健康人群携带沙门氏菌第一类整合子与基因组岛的鉴定及特性分析

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