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表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建及动物免疫试验

作　者: 赵红妮
导　师: 童德文；许信刚
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 基础兽医学
关键词: PCV2 Cap蛋白 减毒鼠伤寒沙门氏菌 活载体疫苗
分类号: S855
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究目的旨在构建一种表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗,通过动物免疫试验对构建的疫苗进行评价。Cap蛋白是PCV2 ORF2基因编码的主要结构蛋白和免疫保护性蛋白,本研究选择截去N端41个氨基酸的核定位区的ORF2编码基因作为目的基因,利用减毒鼠伤寒沙门氏菌的平衡致死系统表达优化的ORF2基因,构建表达Cap蛋白的活载体疫苗,并对重组菌苗的生物学特性和免疫学特性进行评价。研究取得如下结果:1表达猪圆环病毒Cap蛋白的鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建合成特异性引物P1、P2,PCR扩增得到ORF2基因,将其插入经BamH I和Pst I双酶切的Asd+的组成型表达载体pYA3341中,构建重组表达载体pYA3341-ORF2;重组载体电转化入缺失天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Δasd)、腺苷酸环化酶(Δcya)以及环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)的减毒鼠伤寒沙门氏菌中间宿主菌X3730及终末宿主菌X4550中,获得重组活载体疫苗菌X4550(pYA3341-ORF2)。2重组活载体疫苗菌的生物学特性检测研究重组活载体疫菌苗X4550(pYA3341-ORF2)体外稳定特性、生长特性、口服安全性及在小鼠体内的定值分布情况。结果显示,Cap蛋白能在X4550中有高水平的表达,且重组菌能在体外稳定遗传、生长状态良好、口服安全无毒性及在机体中具有良好的定值分布特性。3重组活载体疫苗菌的免疫原性研究将重组活载体疫苗菌X4550(pYA3341-ORF2)口服免疫Balb/C小鼠作为免疫组,以口服重组菌X4550(pYA3341)的小鼠作为阴性对照组,以口服PBS的小鼠作为空白对照组。ELISA方法检测疫苗免疫组小鼠血清抗体效价达到1:1920;间接免疫荧光法检测疫苗免疫组小鼠血清中和抗体效价可达到1:19.2;MTT法检测免疫组小鼠淋巴细胞分裂指数可达到4.26;流式细胞术检测疫苗免疫组小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目分别约为29.9、7.52,CD4+/CD8+T细胞比值约为3.99。将重组活载体疫苗菌X4550(pYA3341-ORF2)免疫猪,ELISA法检测疫苗免疫猪血清抗体效价1:57.6;疫苗免疫组猪血清的中和抗体效价可达到1:11.2;疫苗免疫组淋巴细胞分裂指数可达到3.82。重组菌苗X4550(pYA3341-ORF2)能够稳定表达Cap蛋白,具有良好免疫原性,为该疫苗的进一步研制与临床应用提供参考依据。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
文献综述  12-23
  第一章 猪圆环病毒Ⅱ型的研究概况  12-23
    1.1 猪圆环病毒的病原学与流行病学特征  12-13
    1.2 猪圆环病毒Ⅱ 型的分子生物学特征  13-15
      1.2.1 基因序列特征  13
      1.2.2 PCV2 的主要结构蛋白  13-15
    1.3 猪Ⅱ 型圆环病毒的致病机制  15-17
      1.3.1 致病机制  15-16
      1.3.2 PCV2 的嗜组织特性  16
      1.3.3 PCV2 侵袭宿主细胞引起其增殖的特性  16
      1.3.4 免疫抑制  16-17
      1.3.5 诱发因素  17
    1.4 PCV2 综合防治措施  17-18
      1.4.1 做好引种检疫  17
      1.4.2 强化饲养管理，减少应激  17-18
      1.4.3 定期消毒  18
      1.4.4 免疫预防  18
      1.4.5 药物预防  18
    1.5 PMWS 的诊断  18-20
      1.5.1 临床诊断  18
      1.5.2 PCV2 感染的病理学诊断  18
      1.5.3 病原学诊断  18-20
    1.6 疫苗的研究进展  20-23
      1.6.l 灭活疫苗  20-21
      1.6.2 弱毒活疫苗  21
      1.6.3 基因工程疫苗  21-23
试验研究  23-61
  第二章 表达PCV2 CAP 蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建  23-47
    2.1 材料  23-26
      2.1.1 毒（菌）株、质粒  23-24
      2.1.2 工具酶及主要试剂  24
      2.1.3 仪器设备  24
      2.1.4 培养基  24-25
      2.1.5 溶液的配制  25-26
    2.2 方法  26-36
      2.2.1 PCR 引物合成  26
      2.2.2 PCV2 ORF2 基因的扩增  26
      2.2.3 PCR 产物电泳检测及回收  26
      2.2.4 克隆载体的构建  26-29
      2.2.5 重组表达质粒 pYA3341-ORF2 的构建  29-32
      2.2.6 pYA3341-ORF2 重组质粒依次转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730 和X4550  32-33
      2.2.7 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）表达蛋白的鉴定  33-35
      2.2.8 重组菌苗X4550(pYA3341-ORF2)体外特性检测  35-36
    2.3 结果及分析  36-42
      2.3.1 PCR 扩增目的基因  36
      2.3.2 重组克隆质粒pGEM-T-ORF2 的构建和鉴定  36-37
      2.3.3 重组表达质粒pYA3341-ORF2 的构建和鉴定  37-38
      2.3.4 Cap 蛋白的表达及Western blot 分析  38-39
      2.3.5 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）的体外稳定性  39-40
      2.3.6 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）生长状况分析  40
      2.3.7 重组菌苗的安全性试验  40
      2.3.8 重组菌苗口服免疫后在小鼠体内的分布和表达  40-42
    2.4 讨论  42-46
      2.4.1 目的基因的选择  42
      2.4.2 选择减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体制备口服疫苗的原因  42-43
      2.4.3 沙门氏菌的免疫机制  43
      2.4.4 表达系统的选择—非抗性的载体-宿主平衡致死系统  43-44
      2.4.5 重组疫苗株的稳定性和安全性  44-45
      2.4.6 目的蛋白的表达  45
      2.4.7 关于重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗菌株的转化及鉴定  45-46
    2.5 小结  46-47
  第三章 重组菌苗X4550（PYA3341-ORF2）的动物免疫试验  47-61
    3.1 材料  47-48
      3.1.1 主要试剂  47
      3.1.2 试验器材  47
      3.1.3 试验动物  47-48
      3.1.4 菌种和质粒  48
      3.1.5 溶液的配制  48
    3.2 小鼠免疫试验  48-52
      3.2.1 重组菌X4550（pYA3341-ORF2）和X4550（pYA3341）的大量制备  48
      3.2.2 试验小鼠分组  48-49
      3.2.3 试验小鼠免疫  49
      3.2.4 免疫小鼠血清的收集  49
      3.2.5 免疫小鼠血清抗体效价测定  49-50
      3.2.6 免疫小鼠抗体中和活性测定  50-51
      3.2.7 MTT 检测重组菌苗免疫小鼠脾的T 淋巴细胞增殖  51-52
      3.2.8 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定  52
    3.3 猪免疫试验  52-53
      3.3.1 重组菌X4550（pYA3341-ORF2）和X4550（pYA3341）的大量制备  52
      3.3.2 试验猪分组  52-53
      3.3.3 试验猪免疫  53
      3.3.4 免疫猪血清的收集  53
      3.3.5 免疫猪血清抗体的检测  53
      3.4.6 免疫猪血清抗体中和活性检测  53
      3.3.7 免疫猪外周血淋巴细胞增殖试验  53
    3.4 结果及分析  53-58
      3.4.1 免疫小鼠血清抗体效价检测结果  53-54
      3.4.2 免疫小鼠血清抗体中和活性检测结果  54
      3.4.3 免疫小鼠淋巴细胞增殖试验结果  54-55
      3.4.4 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定结果  55-56
      3.4.5 免疫猪血清抗体的检测  56-57
      3.4.6 免疫猪血清抗体中和活性检测结果  57
      3.4.7 免疫猪淋巴细胞转化试验结果  57-58
    3.5 讨论  58-60
    3.6 小结  60-61
结论  61-62
参考文献  62-70
英文缩略词及中英文对照  70-71
致谢  71-72
作者简介  72

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学
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