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酶法制备马铃薯淀粉磷酸寡糖及相关酶系的研究

作　者: 田晓敏
导　师: 蔡敬民
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 马铃薯淀粉磷酸寡糖黑曲霉复合酶系纳滤核磁共振氢谱
分类号: TS201.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

磷酸寡糖(Phosphoryl Oligosaccharides, POs)是指麦芽低聚糖中的某些葡萄糖残基与磷酸根共价连接的一种新型的功能性低聚糖。马铃薯磷酸寡糖是从马铃薯淀粉酶解液中得到的含有磷酸基团的麦芽低聚糖。除了具有一般低聚糖的生理功能外,还具有促进钙,铁等矿物质吸收的功能。本文阐述了以马铃薯淀粉水解液为原料,采用酶法制备磷酸寡糖。并且比较了马铃薯淀粉水解法,马铃薯淀粉磷酸酯化水解法,玉米淀粉制备麦芽低聚糖酯化法等几种不同的制备方法。其中玉米淀粉制备麦芽低聚糖酯化法所得到的磷酸寡糖得率为最大(3.989%)。本文以纤维素阴离子交换树脂为柱材料,分离出了一组磷酸寡糖,对其组分进行了研究,发现脱去磷酸根的POs主要是由麦芽三糖,麦芽四糖,麦芽五糖,麦芽六糖等组成。计算出PO1与PO2部分的磷酸根聚合度分别为3.98和5.78。除此之外,由于水解马铃薯淀粉存在所用的耐高温α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、普鲁兰酶所需的最适pH、温度差异大,以及上述三种酶需由三种菌株产生、生产成本较高等问题,我们对一组能同时产生酸性α-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶的黑曲霉菌种进行了单因子试验。筛选到一株产酸性α-淀粉酶较佳的菌种PZ301。并对其液态、固态发酵进行了条件研究,确定最佳产酶因素,其中液态发酵的耐酸性α-淀粉酶最高酶活为38.29 IU/mL,糖化酶活为57.58 IU/mL,异淀粉酶活为47.6 U/mL。固态发酵的耐酸性α-淀粉酶最高酶活为779.9 U/g干曲,糖化酶活为1215.8 IU/ g干曲,异淀粉酶活为357U/ g干曲。采用上述黑曲霉产生的复合酶系发酵所得酶液,进行马铃薯淀粉水解,水解不存在pH、温度调节和多个产酶菌种等问题,所需反应时间相对传统制备磷酸寡糖工艺减少。在加入实验室自制酶液50 mL/g时,作用5 h,液化较完全。磷酸寡糖是一组含有磷酸根的麦芽低聚糖,其分子量介于600-1500之间,因此使用纳滤设备可以进行分离。实验室用制备的马铃薯淀粉酶解液进行纳滤,此种方法较树脂有安全,量大的优点。淀粉水解液通过2000道尔顿分子量膜截留与500道尔顿分子量进行截留,一次浓缩,最终得到含有磷酸寡糖的麦芽低聚糖,其中麦芽低聚糖中磷酸寡糖的含量约占1/10。寡糖的回收率为89.23%。最后对纳滤产物进行核磁共振氢谱的检测,证明纳滤产物中含有麦芽三糖,麦芽四糖,麦芽五糖,麦芽六糖和麦芽七糖等寡糖组分。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 文献综述  9-18
  1.1 低聚糖研究现状及作用  9-10
  1.2 磷酸寡糖的研究现状  10-13
    1.2.1 早期对马铃薯淀粉酶解、磷含量和定位检测的研究  10-11
    1.2.2 磷酸寡糖及其钙盐、作用  11-12
    1.2.3 我国对磷酸寡糖的研究近况  12-13
  1.3 磷酸寡糖的制备  13
    1.3.1 磷酸寡糖的制备方法  13
    1.3.2 含磷酸寡糖的麦芽低聚糖的制备工艺及比较  13
  1.4 纳滤技术的应用  13-14
    1.4.1 纳滤技术的简介  13-14
    1.4.2 纳滤技术在功能性低聚糖分离纯化中的应用  14
    1.4.3 纳滤技术的优缺点  14
  1.5 相关酶系的研究现状  14-17
    1.5.1 酸性α-淀粉酶的应用及研究现状  14-15
    1.5.2 高温α-淀粉酶的应用及研究现状  15
    1.5.3 异淀粉酶的应用及研究现状  15-16
    1.5.4 普鲁兰酶的应用及研究现状  16
    1.5.5 糖化酶的应用及研究现状  16-17
  1.6 课题研究的目的及意义  17-18
2 引言  18-19
3 材料与方法  19-28
  3.1 材料  19-20
    3.1.1 菌种  19
    3.1.2 酶制剂  19
    3.1.3 阴离子交换树脂  19
    3.1.4 标准品  19
    3.1.5 主要化学试剂  19
    3.1.6 主要仪器  19
    3.1.7 培养基  19-20
    3.1.8 菌悬液配制  20
    3.1.9 营养盐配制  20
  3.2 试验方法  20-27
    3.2.1 马铃薯淀粉液化条件的研究  20-21
    3.2.2 低DE 值麦芽低聚糖的制备  21-22
    3.2.3 磷酸寡糖的检测方法  22-25
    3.2.4 磷酸寡糖的分离方法  25-26
    3.2.5 制备马铃薯淀粉磷酸寡糖相关酶系的发酵条件研究  26-27
    3.2.6 正交试验设计  27
  3.3 磷酸寡糖的定性分析----核磁共振  27-28
4 结果与分析  28-53
  4.1 磷酸寡糖的检测方法  28-30
    4.1.1 磷含量的测定  28-29
    4.1.2 还原糖的标准曲线  29-30
    4.1.3 市售酶制剂及赠与酶制剂酶活计算  30
  4.2 几种市售酶制剂对马铃薯淀粉液化条件的研究  30-34
    4.2.1 市售耐高温α-淀粉酶对马铃薯淀粉液化DE 值的影响  30-31
    4.2.2 市售普鲁蓝酶、真菌α-淀粉酶作用液化液对糖化作用的影响  31-34
  4.3 柱层析法分离磷酸寡糖的研究  34-36
    4.3.1 不同阴离子交换树脂分离磷酸寡糖的比较  34-35
    4.3.2 洗脱剂浓度的选择  35-36
  4.4 传统酶法制备磷酸寡糖的比较  36
  4.5 黑曲霉复合酶系发酵条件的研究  36-48
    4.5.1 产酶菌种的筛选研究  37
    4.5.2 黑曲霉 PZ301 复合酶系液态发酵条件的优化  37-42
    4.5.3 黑曲霉 PZ301 复合酶系固态发酵条件的优化  42-48
  4.6 黑曲霉复合酶系制备磷酸寡糖  48
    4.6.1 黑曲霉复合酶系的制备  48
    4.6.2 制备磷酸寡糖的放大实验  48
    4.6.3 马铃薯淀粉的酶解  48
  4.7 使用纳滤膜分离磷酸寡糖溶液  48-49
  4.8 核磁共振检测磷酸寡糖  49-53
5 结论与展望  53-54
参考文献  54-60
致谢  60-61
作者简介  61
在读期间发表的学术论文  61

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