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小鼠Foxp3-△PRD/△FKH基因克隆及其功能的研究

作　者: 申卫红
导　师: 邵启祥
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: PTD Foxp3 △PRD △FKH 免疫抑制
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 4次
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内容摘要

目的:克隆小鼠Foxp3-△PRD(N末端富含脯氨酸区域缺失的Foxp3片段)和Foxp3-△FKH(C末端FKH区域缺失的Foxp3片段)基因,构建带穿膜序列PTD(protein transduction domain)的原核表达载体,表达、纯化并复性PTD-△PRD、PTD-△FKH、PTD-eGFP-△PRD、PTD-eGFP-△FKH融合蛋白,并初步探讨其生物学功能,为进一步研究Foxp3的免疫抑制机制奠定基础。方法:(1)利用PCR技术扩增获得小鼠△PRD和△FKH基因,将其克隆至pMD18-T载体,进行单、双酶切鉴定及序列分析。(2)将测序正确的△PRD和△FKH基因克隆到带穿膜序列的pET28a-PTD和pET28a-PTD-eGFP原核表达载体中,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达,获得带有His标签的融合蛋白,利用Bio-Rad公司的镍柱纯化融合蛋白,并进行蛋白复性。(3)利用Western-blot技术检测融合蛋白表达的正确性,流式细胞术和Western-blot检测融合蛋白穿膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白对T细胞活化增殖能力的调节。结果:成功构建了具有穿膜功能的原核表达载体,表达、纯化并复性了带His标签的融合蛋白,Western-blot证实了融合蛋白表达的准确性,流式细胞术和Western-blot证实PTD能携带Foxp3相关蛋白有效的进入细胞内,同时经混合淋巴细胞反应证明PTD-△PRD融合蛋白抑制T细胞活化增殖的能力高于PTD-△FKH融合蛋白,说明C末端的FKH区域在Foxp3的抑制功能中起重要的作用,而N末端的富含脯氨酸区域也具有一定的抑制功能。结论:成功表达具有生物学活性的带穿膜序列的Foxp3相关融合蛋白,Western-blot和流式细胞术证实融合蛋白能有效地进入细胞并定位于细胞核内,为进一步研究Foxp3的其它功能片段及其免疫抑制机制奠定了基础。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
第一章绪论  12-22
  1.1 Foxp3在免疫调节中的作用  12-18
    1.1.1 调节性T细胞及其在免疫调节中的作用  12
    1.1.2 Foxp3的一般特性  12-13
    1.1.3 Foxp3的生物学功能  13-14
    1.1.4 Foxp3的信号通路  14-16
    1.1.5 Foxp3在自身免疫性疾病中的作用  16-18
  1.2 PTD在蛋白转导中的作用  18-19
  1.3 本研究的目的和研究内容  19-22
    1.3.1 研究目的  19
    1.3.2 研究意义  19
    1.3.3 研究方法及技术  19-20
    1.3.4 试验方案的设计  20-22
第二章小鼠Foxp3-△PRD/△FKH基因的克隆  22-32
  2.1 材料方法  22-27
  2.2 结果  27-31
  2.3 讨论  31-32
第三章小鼠PTD-Foxp3相关融合蛋白的表达、纯化及复性  32-44
  3.1 材料方法  32-37
  3.2 结果  37-43
  3.3 讨论  43-44
第四章小鼠PTD-Foxp3相关融合蛋白功能的初步研究  44-52
  4.1 材料方法  44-46
  4.2 结果  46-49
  4.3 讨论  49-52
第五章主要结论和展望  52-54
  5.1 主要结论  52
  5.2 展望  52-54
参考文献  54-60
附录  60-62
致谢  62-64
攻读硕士期间发表的论文  64

小鼠Foxp3-△PRD/△FKH基因克隆及其功能的研究

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