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高效表达重组HIV-1膜蛋白gp41及其在尿液检测中的应用

作　者: 张晓光
导　师: 曾毅；周玲；陈国敏
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 免疫学
关键词: HIV gp41 diagnosis Urine ELISA
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

人获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS),简称艾滋病,是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的。自1983年中国出现首例HIV感染者至2007年10月底,中国累计报告艾滋病病毒感染者223501例,其中艾滋病病人62838例,死亡报告22205人。尽管经过20多年的研究,在HIV基础研究和预防治疗方面取得了较大进展,但是现在仍然没有彻底治愈AIDS的手段和令人满意的疫苗。目前控制HIV流行的主要方法是仍然是行为干预。因此,及早发现HIV感染病例对控制HIV流行起着举足轻重的作用。HIV感染人体后,患者体内可产生针对HIV结构蛋白的特异性抗体,包括核心蛋白(P24、P17);膜蛋白(HIV-1:Gp160、Gp120、Gp41;HIV-2:Gp140、Gp105、Gp36)以及病毒酶蛋白(P66、P31)的抗体。其中外膜蛋白的抗体在病人一经产生就一直维持较高水平,因此,检测HIV—1膜蛋白的抗体,特别是gp41的抗体是判断是否感染HIV的标准之一。常规HIV检测通常是以血液为检测对象,近年来以尿液、口腔渗出液为样本的HIV检测试剂逐渐受到关注。与血液检测试剂相比,这些检测试剂具有无创、无传染性等优点,在快速检测、研究同性恋等特定人群的HIV感染情况等领域得到了一定程度的应用。与血液检测试剂相比,因为尿液中的HIV特异性抗体浓度低,尿液HIV检测试剂对使用的抗原的质量要求更高。本文以研制高质量HIV-1 gp41诊断用抗原,制备HIV—1尿液检测试剂为目的,包括如下几个方面的内容:1、重组gp41的基因优化及原核表达质粒的构建:在本室保存的HIV-1 gp41表达质粒pGEX-5X-1-rgp41的基础上,用长引物多聚酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)法对gp41基因上游80bp进行大肠杆菌偏爱密码子优化,经过2轮PCR反应完成了基因优化并在基因上下游引入了酶切位点;然后将优化后的基因分别插入到原核表达载体pTXB、pET32a、pET22b中,构建原核表达质粒。2、重组gp41的表达和纯化:分别将上述构建的原核表达质粒进行表达筛选;最终选用pET22b-mgp41进行大量表达和纯化,使用破菌、洗涤包涵体、金属螯合层析和分子筛层析等步骤纯化重组Gp41,最终得到的重组Gp41纯度大于95%。3、重组Gp41大量发酵的工艺摸索:使用小型发酵罐对重组表达菌的大量发酵工艺进行了摸索,通过优化细菌生长条件,2.5L的培养物经过8小时的培养和诱导表达最终可以得到120g湿菌,目标蛋白的表达量达到25%以上。4、尿液HIV—1抗体检测方法的初步建立和样品考核:使用本研究中制备的重组Gp41抗原,制备尿液HIV-1抗体检测试剂盒,并用临床样本对试剂盒进行了样品考核。考核结果显示,本研究建立的HIV-1抗体尿液检测方法的灵敏度和特异性分别达到了100%和98.52%,可以满足HIV-1初筛实验的要求。

全文目录

论文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-13
第一部分重组HIV-1 gp41的基因优化及原核表达质粒的构建  13-23
  材料和方法  14-17
    (一) 实验材料  14
    (二) 实验方法  14-17
  结果  17-21
    (一) 基因优化结果  17-18
    (二) 第一轮PCR结果  18-19
    (三) 第二轮PCR结果  19-21
  讨论  21-23
第二部分重组gp41的表达和纯化  23-35
  实验部分  24-28
    (一) 实验材料  24
    (二) 实验方法  24-28
  结果  28-33
    (一) 构建和鉴定表达载体结果  28-29
    (二) 表达载体的小量表达和鉴定结果  29-30
    (三) Gp41的大量表达并分析目标蛋白的存在状态结果  30-31
    (四) 重组蛋白Gp41的纯化结果  31-33
  讨论  33-35
第三部分 Gp41大量发酵的工艺摸索  35-44
  实验部分  36-39
    (一) 实验材料  36
    (二) 实验方法  36-39
  结果  39-43
    (一) 以高浓度肉汤培养基为基础培养基的发酵条件摸索  39-40
    (二) 以改良高浓度肉汤培养基为基础培养基的发酵结果  40-43
  讨论  43-44
第四部分 HIV-1尿液抗体ELISA检测试剂盒的初步建立和应用  44-59
  实验部分  45-48
    (一) 实验材料  45
    (二) 实验方法  45-48
  结果  48-50
    (一) 尿液HIV-1抗体检测方法的初步建立  48
    (二) HIV-1尿液抗体ELISA检测方法的初步应用结果  48-50
  讨论  50-59
参考文献  59-64
附录一:常用试剂的配制  64-70
附录二:缩写词简表  70-71
附录三:实验中所涉及的方法  71-76
致谢  76

高效表达重组HIV-1膜蛋白gp41及其在尿液检测中的应用

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