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番茄抗坏血酸生物合成酶GME和MIOX的功能分析

作　者: 刘军霞
导　师: 叶志彪
学　校: 华中农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) 抗坏血酸生物合成与代谢遗传转化基因表达肌醇
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

抗坏血酸（AsA）即维生素C,一种水溶性的维生素,是普遍存在于植物组织的一种高丰度小分子物质,在生物体中具有极为重要的代谢和抗氧化功能。它与植物的抗逆性有关,也是保证人类健康所必需的营养物质,但是人类和大多数动物由于缺乏抗坏血酸生物合成途径的最后一步酶,丧失了合成能力,必须从新鲜蔬菜和水果中摄取。植物抗坏血酸生物合成途径的发现意味着我们可以通过基因工程调控植物抗坏血酸的合成,从而增加植物产品的营养价值,增强其本身对逆境的抗性。GDP-甘露糖-3’,5’-差向异构酶（GME）和肌醇氧酶（MIOX）都是抗坏血酸合成途径中的关键酶。而番茄是一种世界上广为栽培的高营养、高价值的蔬菜作物,因此,本实验以番茄为研究对象,将GME、MIOX超量表达载体用农杆菌介导法导入番茄植株中,探讨这两个基因在番茄抗坏血酸生物合成中的功能,分析转基因番茄抗氧化逆境等特性,最后得到具有应用价值的抗坏血酸含量增加的番茄材料。本研究获得的结果主要如下:1.利用农杆菌介导的遗传转化方法将pBzGME1、pBzGME2、pBpGME2、pBMIOX四个载体导入番茄实验品种A57中,得到PCR检测阳性植株65棵。2.对GME基因的正义转基因植株T₀代的抗坏血酸含量测定结果表明:zGME1、zGME2和pGME2正义转基因植株的抗坏血酸都比对照显著增加,在zGME1转基因株系中,叶片和果实的抗坏血酸含量最高的分别比对照提高了56%和61%,zGME2转基因株系叶片和果实的抗坏血酸含量最高的分别比对照增加了31%和57%,pGME2转基因株系叶片和果实的抗坏血酸含量最高的分别比对照增加了54%和103%。3.对MIOX基因的正义转基因植株T₀代的抗坏血酸含量测定结果表明超量表达MIOX可以提高番茄植株的抗坏血酸含量,其中叶片和果实的抗坏血酸含量最高的转基因株系分别比对照增加了38%和61%。4.转基因植株的RT-PCR结果表明,部分转基因植株靶基因的表达量比对照明显增加。5.对非转基因番茄材料A57进行逆境处理,发现GME表达受低温诱导,MIOX表达受高温诱导。6.对GME1、GME2正义转基因番茄材料饲喂AsA,发现AsA对GME酶活性有抑制作用。对MIOX正义转基因材料饲喂肌醇,发现MIOX正义转基因材料合成抗坏血酸能力比对照显著提高。7.对部分转基因植株后代的抗逆性进行了初步观察,结果表明超量表达GME1、GME2基因的转基因植株后代的耐盐性、抗旱性和抗氧化性都有一定程度的提高,而MIOX正义转基因植株的抗氧化性有一定的提高。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略词表  10-12
1 前言  12-21
  1.1 课题的提出  12-13
  1.2 抗坏血酸在植物中的生理功能  13-15
    1.2.1 在抗氧化系统中的作用  13-14
    1.2.2 作为酶的辅助因子  14
    1.2.3 在植物生长中的作用  14-15
  1.3 高等植物中抗坏血酸的生物合成途径  15-16
  1.4 抗坏血酸合成相关酶的研究进展  16-20
    1.4.1 GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)研究进展  16-17
    1.4.2 GDP-甘露糖-3',5'-差向异构酶(GME)的研究进展  17-18
    1.4.3 肌醇氧酶(MIOX)的研究进展  18-19
    1.4.4 L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)研究进展  19-20
  1.5 本研究的目的与内容  20-21
2 材料与方法  21-28
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 植物材料  21
    2.1.2 菌株、基因及质粒载体  21
    2.1.3 试剂与引物  21-22
    2.1.4 所用溶液配方  22
  2.2 实验方法  22-28
    2.2.1 小量法提取番茄DNA  22-23
    2.2.2 Trizol法提取植物总RNA  23-24
    2.2.3 反转录RNA获得cDNA第一条链  24
    2.2.4 农杆菌介导番茄遗传转化  24-25
    2.2.5 转基因番茄植株的分子检测  25-26
    2.2.6 转基因番茄植株AsA含量的测定  26
    2.2.7 添加AsA、MI对GME、MIOX酶活性的影响  26
    2.2.8 转基因材料抗逆性的初步分析  26-28
3 结果与分析  28-47
  3.1 转基因植株的获得  28-29
  3.2 转基因植株的分子检测  29-34
    3.2.1 T_0代转基因番茄的PCR检测  29-30
    3.2.2 T_0代转基因番茄植株靶基因表达量分析  30-32
    3.2.3 T_1代转基因番茄的遗传分析  32-34
  3.3 基因组织表达特异性分析  34-36
    3.3.1 GME1基因在番茄不同组织中的表达分析  34-35
    3.3.2 GME2基因在番茄不同组织中的表达分析  35
    3.3.3 MIOX基因在番茄不同组织中的表达分析  35-36
  3.4 转基因番茄T_0代AsA含量测定  36-40
    3.4.1 GME1转基因番茄T_0代AsA含量测定  36-37
    3.4.2 GME2转基因番茄T_0代AsA含量测定  37-39
    3.4.3 MIOX转基因番茄T_0代AsA含量测定  39-40
  3.5 添加AsA、MI分别对GME酶活性、MIOX酶活性的影响  40-41
    3.5.1 AsA对GME酶活性的影响  40-41
    3.5.2 MI对MIOX酶活性的影响  41
  3.6 转基因材料抗逆性的初步分析  41-44
    3.6.1 逆境下基因表达分析  41-42
    3.6.2 种子发芽耐盐性实验  42-44
  3.7 转基因植株离体叶片失水率  44-45
  3.8 转基因植株抗氧化能力检测  45-47
4 讨论  47-51
  4.1 有关GDP-甘露糖-3',5'-差向异构酶  47
  4.2 有关肌醇氧酶  47-48
  4.3 KM喷施方法研究转基因植株后代遗传分离的初步探讨  48-49
  4.4 抗坏血酸含量测量方法  49
  4.5 转基因调控抗坏血酸生物合成的效果  49-50
  4.6 通过调控VC合成基因达到提高植物抗逆性的可行性分析  50-51
参考文献  51-59
致谢  59

番茄抗坏血酸生物合成酶GME和MIOX的功能分析

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