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水稻OsNPR1基因对辣椒的转化与CaNPR1-RNAi转基因辣椒的构建

作　者: 罗欢
导　师: 冯家勋
学　校: 广西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻OsNPR1基因 辣椒CaNPR1基因 RNA干涉 遗传转化
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 13次
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内容摘要


拟南芥NPR1基因是拟南芥中系统获得抗性的正调节基因。本实验室从水稻中克隆到一个与NPR1同源的OsNPR1基因，并证明了水稻OsNPR1基因作为关键的调节因子具有正向控制水稻抗病的功能。为研究在双子叶植物辣椒中过量表达单子叶植物水稻的OsNPR1基因能否提高辣椒的广谱抗病性，本工作构建了一个水稻OsNPR1基因的辣椒表达载体，用根癌农杆菌介导的方法转化辣椒品种天等一号，共获得8株卡那霉素抗性再生苗，为下一步进行抗病性检测提供了植物材料。本研究从辣椒中克隆到一个与拟南芥NPR1基因同源的CaNPR1基因的全长cDNA，该基因与拟南芥NPR1基因在mRNA水平上同源性为62.9％，两者的编码产物一致性为49.7％，相似性为65.7％。为鉴定该基因的功能，构建了一个以CaNPR1基因为靶基因的RNA干涉辣椒表达载体pCaNPR1-RNAi，并用根癌农杆菌介导法转化辣椒品种桂研五号，获得了6株卡那霉素抗性再生苗，经PCR检测、Southern杂交证实，这些再生苗均为转基因植株，为进一步鉴定CaNPR1基因的功能奠定了基础。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一章 前言  9-21
  1 植物抗病分子机制及抗病基因工程  9-14
    1.1 植物抗病分子机制  9-10
    1.2 植物抗病基因的克隆及结构、功能  10-11
    1.3 植物抗病过程中的信号传导  11-13
    1.4 植物抗病基因工程  13-14
  2 植物系统获得抗性,SAR  14-17
    2.1 水杨酸是SAR信号转导途径的重要信号分子  14
    2.2 SAR的标志基因  14-15
    2.3 SAR的化学激活剂  15-16
    2.4 NPR1是拟南芥SAR的关键基因  16-17
      2.4.1 NPR1依赖的SA信号途径  16
      2.4.2 NPR1的存在形式、部位及调控SAR之间的关系  16
      2.4.3 NPR1激活PR基因表达的机理  16-17
  3 辣椒抗病基因工程  17-18
  4 RNA干涉(RNA interference,RNAi)技术  18-20
    4.1 RNA干涉的发现  18
    4.2 RNA干涉的定义及其作用机制  18-19
    4.3 RNA干涉技术在功能基因组中的应用  19-20
  5 本研究的目的和意义  20-21
第二章 材料与方法  21-37
  1 质粒与菌株  21
  2 辣椒品种  21
  3 培养基和培养条件  21-23
    3.1 培养基  21-23
      3.1.1 LB培养基  21
      3.1.2 SOC培养基  21-22
      3.1.3 YEB培养基  22
      3.1.4 MS培养基  22-23
    3.2 培养条件  23
    3.3 菌种保藏  23
  4 抗生素及其使用浓度  23
  5 辣椒组织培养所用激素、生长素的配置方法及其使用浓度  23-24
  6 常用溶液及缓冲液  24
  7 质粒DNA的提取  24-25
  8 DNA沉淀  25
  9 DNA溶液中蛋白质及RNA的去除  25-26
  10 DNA片段的酶切、回收、连接和转化  26
  11 辣椒总RNA的提取  26
  12 辣椒全长cDNA的克隆  26-30
    12.1 引物的设计  26-27
    12.2 第一链cDNA的合成  27-28
    12.3 用特异性引物扩增目的基因片段  28-30
    12.4 辣椒全长cDNA的克隆  30
  13 PCR反应体系及反应条件  30-31
    13.1 一般PCR反应体系  30
    13.2 PCR反应条件  30-31
      13.2.1 马铃薯GA20氧化酶基因第一个内含子序列的扩增  30
      13.2.2 辣椒全长cDNA部分区段的扩增  30-31
      13.2.3 对转基因植株外源基因检测的PCR扩增  31
  14 植物总DNA的制备  31-32
    11.1 碱提取法(制备用于PCR检测的DNA粗提液)  31
    11.2 CTAB法(制备用于Southern杂交的植物总DNA)  31-32
  15 Southern杂交  32-34
    15.1 Southern转移  32-33
    15.2 探针标记——随机引物标记  33-34
    15.3 杂交  34
      15.3.1 预杂交  34
      15.3.2 杂交  34
      15.3.3 洗膜  34
      15.3.4 放射自显影  34
  16 三亲本接合(Triparental Conjugation)  34-35
  17 辣椒的遗传转化  35-37
    17.1 辣椒组织培养和遗传转化的培养基  35
    17.2 辣椒的遗传转化  35-37
第三章 结果与分析  37-48
  1 辣椒表达载体pBI121-OsNPR1的构建  37-38
  2 辣椒表达载体pBI121-OsNPR1对天等一号的转化  38-40
    2.1 天等一号的转化及筛选  38-39
    2.2 转基因植株的分子鉴定  39-40
  3 辣椒CaNPR1基因全长cDNA的克隆  40-43
    3.1 CaNPR1的RT-PCR  40-41
    3.2 辣椒CaNPR1基因全长cDNA的克隆  41
    3.3 辣椒CaNPR1基因的同源性比较  41-43
  4 RNA干涉植物表达载体pCaNPR1-RNAi的构建  43-45
  5 辣椒表达载体pCaNPR1-RNAi对桂研五号的转化  45-48
    5.1 桂研五号的转化及筛选  45-46
    5.2 转基因植株的PCR鉴定  46
    5.3 转基因植株的Southern杂交分析  46-48
第四章 讨论  48-50
  1 水稻OsNPR1基因对辣椒的转化  48
  2 辣椒CaNPR1基因  48-49
  3 高效RNA干涉植物表达载体的构建  49-50
参考文献  50-61
致谢  61-62
攻读硕士期间发表论文情况  62

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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