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肠出血性大肠杆菌O157：H7紧密素克隆表达及其免疫原性分析

作　者: 鞠仕亮
导　师: 何孔旺；范红结
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 肠出血性大肠杆菌O157:H7 紧密素蛋白重组亚单位疫苗免疫保护粘附粘附抑制
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

1.肠出血性大肠杆菌O157：H7紧密素部分基因片段的克隆与表达参照GenBank中EHEC O157:H7(参考株EDL933)的紧密素基因序列设计一对特异性引物,用PCR方法扩增紧密素部分编码基因eae,得到2266bp片段,然后克隆到pMD18-T载体中,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-28a(+)-eae,经测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3), ITPG诱导表达,SDS-PAGE检测,并进行表达形式的鉴定,PAGE鉴定获得82kD目的蛋白,超声破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达。包涵体复性后目的蛋白纯化效果明显,纯化后纯度可达90%以上。目的基因高效表达,经Western Blot鉴定该蛋白能被阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。2.肠出血性大肠杆菌O157：H7紧密素蛋白对BALB/c小鼠免疫保护作用试验本实验选用BALB/c小鼠作为研究EHEC O157:H7感染的动物模型,通过皮下免疫途径对EHEC O157:H7的紧密素蛋白进行小鼠免疫保护作用实验研究。每两周免疫一次,共3次。分别于免疫2、3次后的10天断尾采血,ELISA检测血清特异性抗体效价。三免后第7天用致死剂量的O157全菌(1.2×1010CFU)经口灌胃感染小鼠。结果表明,免疫3次后抗体水平有明显的升高。小鼠免疫保护试验结果显示保护率达到80%。免疫后攻菌实验显示疫苗抗原具有较强的保护作用,在新型亚单位疫苗研制中具有应用价值。3.紧密素重组蛋白抗血清对肠出血性大肠杆菌粘附HEp-2细胞的抑制试验表达紧密素重组蛋白,进一步分析其相关生物学功能,分别进行了HEp-2细胞的粘附试验和粘附抑制试验。结果显示肠出血性大肠杆菌EDL933株可以粘附HEp-2细胞。用重组表达的紧密素蛋白免疫动物抗血清处理EDL933,能部分抑制其对HEp-2细胞的粘附。试验证明抗紧密素抗体可以抑制此类细菌在动物体内肠道定居。为进一步研究紧密素(intimin)重组蛋白的生物学功能奠定了基础。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
第一篇文献综述  9-27
  1. 引言  9-10
  2. 病原学  10
  3. 流行病学  10-11
  4. 致病机理与免疫损伤机制  11-12
  5. 临床症状与病理变化  12-13
  6. 毒力因子  13-17
  7 防治策略  17-22
  参考文献  22-27
第二篇试验研究  27-56
  第一章肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素部分基因片段的克隆与表达  27-43
    1 材料与方法  27-36
    2 结果  36-40
    3 讨论  40-41
    参考文献  41-43
  第二章肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素蛋白对BALB/C小鼠免疫保护作用试验  43-49
    1 材料与方法  43-45
    2 结果  45-47
    3 讨论  47-48
    参考文献  48-49
  第三章紧密素重组蛋白抗血清对肠出血性大肠杆菌粘附HEP-2细胞的抑制试验  49-56
    1 材料与方法  49-51
    2 结果  51-53
    3 讨论  53-55
    参考文献  55-56
全文总结  56-57
附录:常用试剂的配制  57-61
致谢  61

肠出血性大肠杆菌O157：H7紧密素克隆表达及其免疫原性分析

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