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利用mRNA差异显示技术对苏淮白猪肌内脂肪沉积相关调控基因的分析

作　者: 李开桢
导　师: 黄瑞华；刘红林
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 苏淮白猪 肌内脂肪 差异显示逆转录PCR BLASTn 相对定量
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


肉质性状,尤其是肌内脂含量的改良是近阶段猪育种工作的主要目标之一。不同猪种尤其是中国地方猪种与外国引进猪种在肉质性状和肌内脂含量上表现着极大的差异。本研究通过差异显示逆转录聚合酶链式反应(DDRT-PCR)的方法鉴定在肌内脂肪含量差异极显著的个体间背最长肌差异表达的基因,旨在寻找参与肌内脂肪沉积调控的相关基因,并为猪的肌内脂肪性状选育提供理论依据和技术支持。从20头180日龄苏淮白猪中分别选取肌内脂肪含量最高和最低各5个个体组成两组,其平均肌内脂肪含量分别为H组(3.251%±0.327%)和L组(1.469%±0.119%),组间差异极显著(p<0.01)。采用3条锚定引物,15条随机引物组合进行DDRT-PCR,获得差异表达条带并测序,通过NCBI比对发现其中3条差异序列与已知基因高度同源。分别命名为clonel(233bp),clone2(518 bp),clone3(562bp)。其中clonel与分选连接蛋白SNX17高度同源,同源性为99%,登录号为NM014748；clone2与人类剪切因子精氨酸-丝氨酸富集蛋白SFRS18有高度同源性,同源性为97%,登录号为NM015491；clone3与人的肌凝蛋白重链MYH4有高度同源性,同源性别为89%,登录号为NM017533。通过RT-PCR相对定量验证H组、L组上述三个基因是否假阳性。SNX17基因与SFRS18基因均验证了DDRT-PCR非假阳性,SNX17基因在高肌内脂含量组中的表达强于低含量组,SFRS18与此相反。而MYH4基因具有假阳性,在高低含量中的表达没有显著差异。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-12
第一章 文献综述  12-28
  1 肌肉与肌内脂肪  12-16
    1.1 肌肉的结构特征  12-13
    1.2 肌肉的生成过程  13-14
    1.3 肌内脂肪  14-16
  2 猪肌内脂肪含量相关的侯选基因  16-18
    2.1 心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因  16-17
    2.2 脂蛋白脂肪酶基因  17
    2.3 激素敏感脂肪酶基因  17-18
    2.4 其他影响猪IMF含量的QTL  18
  3 mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)及其研究进展  18-24
    3.1 DDRT-PCR技术原理  18-19
    3.2 DDRT-PCR优缺点  19-20
    3.3 DDRT-PCR技术发展与改进  20-23
    3.4 DDRT-PCR在猪育种中的应用  23-24
  4 本研究的目的意义  24-28
第二章 差异条带的获得与测序比对  28-48
  1 实验材料  28-31
    1.1 试验动物  28-29
    1.2 网络资源及软件  29
    1.3 试剂  29-30
    1.4 仪器设备  30-31
  2 实验方法  31-36
    2.1 背最长肌肌内脂肪含量的测定  31
    2.2 背最长肌组织RNA提取  31-32
    2.3 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量  32
    2.4 RNA池的制备  32
    2.5 DNase Ⅰ处理  32-33
    2.6 cDNA的合成  33
    2.7 DDRT-PCR反应  33-34
    2.8 12%聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳  34
    2.9 银染法显色  34-35
    2.10 差异片段的切取  35
    2.11 差异片段的再扩增  35
    2.12 PCR产物测序  35-36
    2.13 数据统计  36
  3.结果  36-44
    3.1 背最长肌肌内脂肪含量的测定  36-37
    3.2 RNA纯度与浓度  37
    3.3 cDNA鉴定结果  37-38
    3.4 mRNA差异显示结果  38-39
    3.5 差异片段的回收与再次扩增  39
    3.6 差异片段纯化测序  39
    3.7 差异片段的序列分析  39-44
  3 讨论  44-48
    3.1 适宜猪背最长肌mRNA差异显示分析总RNA的提取  44-45
    3.2 猪背最长肌mRNA差异显示技术反应体系优化及建立  45-46
    3.3 SNX17、SFRS18、MYH4基因与其所属蛋白家族  46-48
第三章 SNX17、SFRS18与MYH4的DDRT-PCR结果鉴定  48-56
  1 实验材料  48-49
    1.1 试验动物  48
    1.2 网络资源及软件  48
    1.3 试剂  48-49
    1.4 仪器设备  49
  2 实验方法  49-52
    2.1 RNA提取与RNA池的制备  49
    2.2 第一链cDNA的合成  49-50
    2.3 PCR扩增  50-51
    2.4 数据分析  51-52
  3 结果与分析  52-56
全文结论  56-58
参考文献  58-66
附录  66-70
致谢  70-72
攻读硕士研究生期间发表论文情况  72

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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