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由顺丙烯磷酸到磷霉素的生物转化研究

作　者: 邓小丽
导　师: 徐慧
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 生物化工
关键词: 磷霉素菌种选育工艺优化超声加载转化途径
分类号: TQ465
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

磷霉素是一种具有独特化学结构与抗菌机制的抗生素。目前以对称性化学合成技术生产磷霉素,探索不对称性的生物转化或化学合成技术是一个研究热点。本实验室已筛选得到能将底物顺丙烯磷酸(cPA)转化合成磷霉素(FOM)菌株F79(Bacillus fusiformis),由于该菌株的磷霉素产率及产量较低而无法实现工业化生产,本论文研究的目的就是提高菌株的转化产率和产量,为实现把生物技术用于磷霉素的工业化生产提供理论依据。采用紫外(UV)+亚硝基胍(NTG)复合诱变方法处理复壮后菌株F79,以含最低抑菌浓度(MIC)FOM的分离培养基作为抗性筛选的分离平板,挑选生长良好的菌落进行初筛、复筛。得到一株高产、稳定的FOM生产菌株FUN5,当底物浓度为0.8%时,FOM产量由1.06mg.mL-1提高至2.20mg／mL,转化产率提高了13.04%。对FUN5的种子培养工艺进行了研究,确定当T=37℃,pH=7.0时菌体生长最佳。同时本文也获得了该菌的生长曲线。对FUN5的发酵工艺进行了研究,结果表明：最优发酵培养基配方为：甘油3%,硫酸铵1%,酵母膏0.3%,0.5%NaCl,0.02%NaVO3,0.03%CoCl6.2H2O；最优发酵条件为：接种量8%；初始pH值为7.5；培养温度为34℃；底物浓度为0.8%；发酵周期为96h。产物的抑制作用是影响FOM转化合成的一个主要原因,本文利用低强度超声波刺激来改变细胞膜通透性,增加代谢产物的排出速率。通过对一系列超声参数的考察,确定当超声频率为20kHz,每次作用时间为15min时,超声的促进作用最为明显。发酵后的78-90h是超声波处理最佳时间段,每隔2h超声处理一次FOM的产量由2.50 mg.mL-1提高到2.67mg.mL-1。本文还尝试用化学-酶偶联方法来代替两步酶催化法,来消除底物cPA对转化的抑制作用,但实验结果并不理想。至于细菌体内由cPA到FOM的转化途径到底是怎样的还有待进一步的研究。

全文目录

目录  7-11
摘要  11-12
Abstract  12-14
第一章绪论  14-25
  1.1 磷霉素概述  14-17
    1.1.1 磷霉素的理化性质  15
    1.1.2 磷霉素的抗菌机制  15
    1.1.3 磷霉素的耐药机制  15-16
    1.1.4 磷霉素的合成代谢途径  16-17
    1.1.5 磷霉素的工业生产  17
  1.2 磷霉素的手性合成研究现状  17-20
    1.2.1 磷霉素的生物转化法合成研究进展  17-19
    1.2.2 磷霉素的化学不对称合成研究状况  19-20
    1.2.3 手性生物转化和化学不对称合成的比较  20
  1.3 磷霉素生物转化合成菌种的选育和转化特性研究状况  20-21
    1.3.1 磷霉素生物环氧化菌的选育  20
    1.3.2 发酵条件的影响  20-21
  1.4 发酵液中磷霉素的检测方法  21-23
    1.4.1 磷霉素的微生物检测方法  21
    1.4.2 磷霉素的薄层色谱分析方法  21-22
    1.4.3 磷霉素的HPLC检测方法  22
    1.4.4 发酵液中磷霉素对映体纯度的测定方法  22-23
  1.5 本论文的立题依据和主要研究内容  23-25
    1.5.1 立题依据  23
    1.5.2 研究内容  23-25
第二章 F79发酵液中磷霉素的定量及定性检测  25-30
  2.1 F79发酵液中FOM的定量检测  25-28
    2.1.1 材料与仪器  25-26
    2.1.2 实验方法  26-27
    2.1.3 结果与分析  27-28
  2.2 F79发酵液中FOM的定性检测  28-29
    2.2.1 材料与仪器  28
    2.2.2 实验方法  28-29
    2.2.3 实验结果与分析  29
  2.3 本章小节  29-30
第三章磷霉素产生菌的定向控制育种及转化特性研究  30-39
  3.1 磷霉素产生菌的定向控制育种  30-36
    3.1.1 材料与仪器  30-31
    3.1.2 实验方法  31-32
    3.1.3 实验结果  32-36
  3.2 出发菌株F79和诱变后菌株FUN_5的转化合成特性比较  36-37
    3.2.1 实验材料  36
    3.2.2 实验方法  36
    3.2.3 实验结果  36-37
  3.3 本章小结  37-39
第四章磷霉素产生菌FUN_5液体种子培养工艺研究  39-43
  4.1 材料与仪器  39
    4.1.1 材料  39
    4.1.2 主要仪器  39
  4.2 实验方法  39-40
    4.2.1 不同培养温度对菌体生长影响的研究  39-40
    4.2.2 不同pH值对菌体生长影响的研究  40
    4.2.3 FUN_5生长曲线的绘制  40
  4.3 实验结果  40-42
    4.3.1 不同培养温度对菌体生长影响的研究  40-41
    4.3.2 不同pH值对菌体生长影响的研究  41-42
    4.3.3 FUN_5的生长曲线图  42
  4.4 本章小节  42-43
第五章 FUN_5转化合成磷霉素的发酵工艺研究  43-51
  5.1 材料与仪器  43
    5.1.1 实验材料  43
    5.1.2 主要仪器  43
  5.2 发酵培养基的优化研究  43-49
    5.2.1 碳源对发酵的影响  43-44
    5.2.2 氮源对转化的影响  44-45
    5.2.3 最佳培养基组合  45-46
    5.2.4 金属离子对转化的影响  46-47
    5.2.5 不同接种量对转化的影响  47-48
    5.2.6 pH值对转化的影响  48
    5.2.7 不同培养温度对转化的影响  48-49
    5.2.8 底物浓度与转化的关系  49
  5.3 本章小节  49-51
第六章通过低强度超声波刺激提高FUN_5的FOM产量  51-56
  6.1 材料与仪器  51-52
    6.1.1 实验材料  51-52
    6.1.2 主要仪器  52
  6.2 实验方法  52
    6.2.1 培养条件  52
    6.2.2 超声处理  52
    6.2.3 参数测定  52
  6.3 实验结果  52-55
    6.3.1 超声处理对菌体生长和FOM产量的影响  52-53
    6.3.2 超声不同时间对FUN_5转化合成磷霉素的影响  53
    6.3.3 在FUN_5转化发酵的不同时间加载超声刺激对磷霉素产量的影响  53-54
    6.3.4 不同周期超声刺激对FOM转化合成的影响  54-55
  6.4 本章小结  55-56
第七章底物的化学修饰  56-61
  7.1 材料与仪器  57
    7.1.1 材料  57
    7.1.2 主要仪器  57
  7.2 实验方法  57-58
    7.2.1 底物的化学修饰过程  57-58
    7.2.2 发酵转化  58
  7.3 实验结果  58-60
    7.3.1 以cPA与HXO的加成反应产物为底物进行转化菌体的生长情况  58-59
    7.3.2 以cPA与HXO的加成反应产物为底物进行转化后发酵液中FOM的测定结果  59-60
  7.4 讨论  60-61
全文总结  61-63
参考文献  63-68
发表文章  68-69
致谢  69

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