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微囊藻毒素对哺乳动物和鱼类线粒体毒效应的研究

作　者: 赵雁雁
导　师: 谢平
学　校: 华中农业大学
专　业: 水生生物学
关键词: 微囊藻毒素哺乳动物鱼类线粒体抗氧化酶超微结构呼吸链酶复合物 ATP酶
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

线粒体是维持细胞正常结构和功能的重要细胞器,因此很容易遭受各种毒素的侵害。目前,微囊藻毒素（MCs）对动物机体影响的研究较多集中在组织、细胞和分子水平,对亚细胞器的研究较少。本文系统的研究并比较了MCs对哺乳动物（家兔）和鱼类（鲫）两种不同类群动物线粒体的影响,分别从线粒体超微结构的病理变化、生理生化重要酶系和线粒体的氧化应激等方面探讨了MCs对线粒体的毒作用机制。目前,机体的氧化损伤和细胞凋亡被认为是MCs的主要毒作用途径,而线粒体在机体的氧化损伤和细胞凋亡或死亡的过程中有着关键性的作用。因此,本文从组织的氧化损伤研究开始,通过比较MCs对两种不同类群动物线粒体的毒效应及同一动物不同组织的线粒体对MCs生化响应的差异,探讨并归纳了线粒体损伤在MCs诱导细胞毒性中的可能作用机制,为探讨MCs的致毒机理提供进一步的参考依据。主要结果如下:1)试验表明,MCs能够引起两种动物肝组织的急性氧化损伤,即SOD、CAT、GPx和GR抗氧化酶活性都有明显的变化并伴随着脂质过氧化水平（LPO）的显著升高,然而两种动物肝脏的主要抗氧化酶系对MCs的生化响应明显不同:家兔各抗氧化酶指标与对照组相比明显降低而鲫则明显升高,说明不同动物类群对MCs的毒效应有其自身的响应和抵御机制:在MCs对家兔的亚急性试验中,我们对家兔腹腔注射2μg/kg bw MCs/24h,分别在7d和14d发现,超低浓度MCs持续染毒也能引起家兔肝、肾和脑不程度的氧化损伤,只是SOD、CAT、GPx和GR在不同组织中的响应不同,说明即使是超低浓度的MCs也会对动物产生一定的损伤且不同组织对MCs的毒效应有其不同的适应和补偿性机制。2)在家兔的体内试验中,我们对家兔腹腔注射12.5和50μg/kg bw剂量的MCs粗提液后,分别在1、3、12、24、48h检测了肝脏和心肌线粒体的毒效应情况。试验表明,MCs诱导了线粒体超微结构的改变和明显的脂质过氧化损伤,且高浓度组MCs毒效应表现出不可恢复性特征。同时MCs改变了线粒体呼吸链酶复合物NADH脱氢酶和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性以及影响了Na⁺-K⁺-ATP和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶的活性,随之可能导致线粒体离子平衡的破坏而引起线粒体膜电位（MMP）的丧失。因此,本试验表明MCs对肝脏和心肌线粒体均有明显的损伤作用。不同的是,MCs对肝脏线粒体的影响明显比心肌的严重,且低浓度MCs对肝脏线粒体的损伤作用随着染毒时间的延长有一定的恢复现象。3)在MCs对鲫肝线粒体的毒效应试验中,腹腔注射50和200μg/kg bw剂量的MCs粗提液后,分别在1、3、12、24、48h检测了MCs对肝脏线粒体的毒效应情况,发现,鲫肝线粒体超微结构、线粒体呼吸链酶复合物及ATP酶等重要生理生化酶系也发生了明显的变化。与家兔肝线粒体损伤情况相比,发现:两种动物线粒体超微结构的变化规律一致;然而两种动物重要酶类对MCs的响应具有明显差异,鱼类线粒体各种指标在MCs作用下均明显低于对照组水平,具有一定的同一性和规律性,而哺乳动物线粒体对MCs的响应情况则更为复杂多变;而且,随着MCs染毒时间的延长,鲫肝线粒体损伤从整体上表现出了更好的恢复性特征。综上所述,MCs对不同种类动物线粒体和同种动物不同组织线粒体有着不同的毒效应机制。然而,不管是何种情况,MCs诱导的线粒体损伤是其对细胞毒性作用的机制之一。我们认为,MCs毒作用的线粒体途径,一方面通过线粒体损伤,产生大量的ROS引起组织抗氧化系统的破坏,而对机体产生危害;另一方面,MC可能通过影响线粒体的呼吸链和磷酸化系统,使细胞能量和相关代谢发生紊乱,并通过氧化损伤作用破坏线粒体的离子平衡等功能而最终诱发细胞凋亡程序的发生,对细胞产生毒作用。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-14
缩略语表  14-15
第一章文献综述  15-22
  1 我国水体富营养化现状及危害  15-16
    1.1 我国水体富营养化现状  15
    1.2 水体藻毒素污染及流行病学调查  15-16
  2 微囊藻毒素的一般概况  16-19
    2.1 MC的化学结构及理化性质  16-17
    2.2 MC的毒性研究  17-19
      2.2.1 肝毒性  17-18
      2.2.2 肾毒性  18
      2.2.3 遗传毒性  18-19
      2.2.4 其他毒性  19
  3 哺乳动物和鱼类对MC毒性的不同响应  19-20
  4 MC致毒机理研究  20-21
  5 本研究的目的和意义  21-22
第二章微囊藻毒素对家兔线粒体毒性作用研究  22-58
  第一节微囊藻毒素对家兔肝脏急性氧化损伤研究  22-32
    1 引言  22-23
    2.材料与方法  23-25
      2.1 微囊藻毒素制备与检测  23
      2.2 试验动物  23
      2.3 LD_(50)测定  23-24
      2.4 染毒取样  24
      2.5 肝脏匀浆液的制备  24
      2.6 肝生化参数的测定  24-25
        2.6.1 超氧化物歧化酶(SOD,EC 1.15.1.1)活性测定  24
        2.6.2 过氧化氢酶(CAT,EC 1.11.1.6)活性测定  24
        2.6.3 谷胱甘肽过氧化物酶(GPx,EC 1.11.1.19)活性测定  24-25
        2.6.4 谷胱甘肽还原酶(GR,EC 1.6.4.2)活性测定  25
        2.6.5 脂质过氧化水平(LPO)的测定  25
        2.6.6 蛋白含量的测定  25
      2.7 统计分析  25
    3 结果  25-30
      3.1 家兔48 h LD_(50)及染毒期间死亡情况  25-26
      3.2 SOD活性的变化  26-27
      3.3 CAT活性变化  27-28
      3.4 GPx活性变化  28-29
      3.5 GR活性变化  29-30
      3.6 LPO水平变化  30
    4 讨论  30-32
  第二节微囊藻毒素对家兔不同组织亚急性氧化损伤研究  32-40
    1 引言  32
    2 材料与方法  32-33
      2.1 试验动物  32-33
      2.2 染毒与采样  33
      2.3 各组织匀浆的制备  33
      2.4 各组织抗氧化酶活性的检测和蛋白定量  33
      2.5 统计分析  33
    3 结果  33-38
      3.1 脂质过氧化水平  33-34
      3.2 各组织抗氧化酶活性的变化  34-38
    4 讨论  38-39
    5 小结  39-40
  第三节微囊藻毒素对家兔肝脏线粒体的影响  40-50
    1 引言  40
    2 材料和方法  40-42
      2.1 藻毒素的制备和检测  40
      2.2 试验动物  40-41
      2.3 染毒与采样  41
      2.4 肝线粒体的提取  41
      2.5 蛋白定量  41
      2.6 肝线粒体电镜观察  41
      2.7 肝线粒体LPO水平的检测  41-42
      2.8 肝线粒体SOD活性的检测  42
      2.9 肝线粒体呼吸链酶复合物活性的测定  42
      2.10 肝线粒体ATP酶的检测  42
      2.11 统计分析  42
    3 结果  42-48
      3.1 动物染毒后死亡情况  42-43
      3.2 肝线粒体的超微结构变化  43-44
      3.3 肝线粒体MDA含量  44-45
      3.4 肝线粒体SOD活性  45
      3.5 肝线粒体呼吸链酶复合物活性  45-47
      3.6 肝线粒体ATP酶活性  47-48
    4 讨论  48-50
  第四节微囊藻毒素对家兔心肌线粒体的影响  50-58
    1 引言  50
    2 材料和方法  50-51
      2.1 藻毒素的制备和检测  50
      2.2 试验动物  50
      2.3 染毒与采样  50
      2.4 心肌线粒体的提取  50-51
      2.5 蛋白定量  51
      2.6 心肌线粒体电镜观察  51
      2.7 心肌线粒体LPO水平的检测  51
      2.8 心肌线粒体SOD活性的检测  51
      2.9 心肌线粒体呼吸链酶复合物活性的测定  51
      2.10 心肌线粒体ATP酶的检测  51
      2.11 统计分析  51
    3 结果  51-57
      3.1 动物染毒后死亡情况  51-52
      3.2 心肌线粒体的超微结构变化  52-53
      3.3 心肌线粒体MDA含量  53-54
      3.4 心肌线粒体SOD活性  54
      3.5 心肌线粒体呼吸链酶复合物活性  54-56
      3.6 心肌线粒体ATP酶活性  56-57
    4 讨论  57
    5 小结  57-58
第三章微囊藻毒素对鲫肝脏线粒体的影响  58-82
  第一节微囊藻毒素对鲫肝脏损伤的研究  58-66
    1 引言  58-59
    2 材料和方法  59-60
      2.1 微囊藻毒素的制备与检测  59
      2.2 试验动物  59
      2.3 染毒与采样  59
      2.4 血样采集  59-60
      2.5 肝组织匀浆的制备  60
      2.6 血清酶学指标测定  60
      2.7 鲫肝抗氧化酶指标检测  60
      2.8 鲫肝LPO水平的检测  60
      2.9 统计分析  60
    3 结果  60-63
      3.1 鲫血清酶变化  60-61
      3.2 鲫肝脏抗氧化酶活性变化  61-63
      3.3 LPO水平的变化  63
    4 讨论  63-66
      4.1 MC对鲫血清酶的影响  63-64
      4.2 MC对鲫肝脏抗氧化系统的影响  64-66
  第二节微囊藻毒素对鲫肝线粒体的影响  66-82
    1 引言  66
    2 材料和方法  66-68
      2.1 试验鱼  66-67
      2.2 染毒与取样  67
      2.3 电镜样品的制备与观察  67
      2.4 线粒体的提取  67
      2.5 蛋白定量  67
      2.6 线粒体LPO水平的检测  67
      2.7 线粒体SOD活性的检测  67
      2.8 线粒体GPx活性的检测  67
      2.9 肝线粒体呼吸链酶复合物活性的测定  67-68
        2.9.1 NADH脱氢酶活性的测定  67-68
        2.9.2 琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的测定  68
        2.9.3 细胞色素氧化酶(COX)活性的测定  68
      2.10 线粒体ATP酶(Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶)的检测  68
      2.11 统计分析  68
    3 结果  68-78
      3.1 鲫线粒体超微结构的变化  68-71
      3.2 鲫线粒体SOD活性的变化  71-72
      3.3 鲫线粒体GPx活性的变化  72-73
      3.4 鲫线粒体LPO水平的变化  73-74
      3.5 鲫线粒体呼吸链酶复合物活性的变化  74-77
        3.5.1 NADH脱氢酶活性的变化  74-75
        3.5.2 SDH活性变化  75-76
        3.5.3 COX活性的变化  76-77
      3.6 鲫线粒体ATP酶活性的变化  77-78
        3.6.1 Na~+-K~+-ATP酶活性的变化  77-78
        3.6.2 Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶活性的变化  78
    4 讨论  78-79
    5 小结  79-80
    6 总结  80-82
参考文献  82-91
致谢  91-92
在学期间发表论文情况  92

微囊藻毒素对哺乳动物和鱼类线粒体毒效应的研究

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