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呼吸道合胞病毒治疗性单克隆抗体的制备及其免疫保护作用研究

作　者: 王小波
导　师: 何金生
学　校: 安徽医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 人呼吸道合胞病毒 F蛋白单克隆抗体中和活性融合抑制活性
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV)广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿严重下呼吸道感染最重要的病毒病原。病毒感染机体后的免疫保护机制尚未明确,也无特异性防治方法。本研究尝试利用杂交瘤技术,制备具有中和活性的单克隆抗体,并开展RSV免疫治疗研究,以期为研制具有自主知识产权的RSV治疗性单克隆抗体奠定基础。方法:用RSV活病毒通过滴鼻免疫小鼠,取免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过有限稀释法亚克隆和间接ELISA进行筛选,获得稳定分泌抗RSV单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水,利用G蛋白亲和层析法从腹水中纯化抗体。使用SDS-PAGE检测纯化后抗体的纯度,间接ELISA、间接免疫荧光(indirect immunoflurescence, IIF)和Western blot方法分析抗体对RSV融合蛋白(fusion protein, F)的特异性结合能力,间接ELISA、非竞争ELISA及竞争ELISA分别测定抗体的亚型、亲和常数和抗原识别表位,为了更好的开展抗体生物活性研究,我们还建立了免疫酶法(immunoenzyne, IE)分析RSV病毒滴度的方法,应用IE法体外蚀斑减少中和实验,确定该株单抗的中和活性,并计算中和效价,通过融合抑制实验确定该株单抗是否具有融合抑制活性。用Trizol法从杂交瘤细胞株中提取总RNA,应用鼠源抗体重链和轻链通用引物,通过PCR扩增抗体的轻链和重链可变区基因,并克隆入pGEM-T载体中,进行核酸序列分析,并与现有的RSV单克隆抗体进行同源性比对。利用RSV感染的动物模型,进一步分析单克隆抗体的体内中和活性。结果:获得1株稳定分泌抗RSV F蛋白的杂交瘤细胞株F8,纯化后抗体的纯度达到95%以上。该单抗能够识别F蛋白单体,抗体亚型为IgG1,亲和常数(Ka)为6.8×108 L/mol,抗原识别表位位于F蛋白的抗原表位区205-222位氨基酸。该株单抗可以在体外抑制RSV对HEp-2细胞的感染,具有中和活性,同时具有融合抑制活性。扩增出抗体轻链和重链可变区基因,并克隆入pGEM-T载体中。测序结果显示重链可变区基因序列全长371 bp,编码124个氨基酸;轻链可变区基因序列全长323 bp,编码107个氨基酸,在GeneBank对氨基酸序列进行比对分析,两者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。与美国专利网上提交的具有中和活性的RSV鼠源单抗的重链轻链同源性分别为95.37%与75.4%。抗体体内保护实验显示,该抗体可降低感染RSV小鼠的肺脏病毒滴度。结论:制备了能特异性识别RSV F蛋白的单克隆抗体F8,完成了纯化和性质鉴定,扩增出抗体轻链和重链可变区基因,与已知的具有中和活性的RSV单抗的可变区基因有较高的同源性,可以确定所得到的序列为RSV抗体轻链和重链可变区序列,而非其他基因的序列。以IE法为基础的RSV病毒滴度分析方法显示F8在体内体外具有中和活性和融合抑制活性,为RSV感染的免疫治疗和抗体人源化改造奠定了坚实基础。

全文目录

中英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
实验设计与流程  11-12
前言  12-17
实验材料与方法  17-39
结果  39-52
讨论  52-57
结论  57-58
参考文献  58-61
附录  61-63
致谢  63-64
呼吸道合胞病毒检测技术研究进展  64-71

呼吸道合胞病毒治疗性单克隆抗体的制备及其免疫保护作用研究

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