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精氨酸加压素对抗Aβ_（25-35）神经毒性作用的行为学和电生理研究

作　者: 潘艳芳
导　师: 祁金顺
学　校: 山西医科大学
专　业: 生理学
关键词: 阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白精氨酸加压素 Morris水迷宫 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ 多通道细胞外记录海马大鼠
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是发生在中枢神经系统的一种慢性、原发性、不可逆性的神经退行性疾病,以学习记忆等认知功能障碍、精神行为异常为主要临床表现。AD典型的病理学特征包括脑内出现高密度的老年斑(细胞外)和神经元纤维缠结(细胞内)。其中,老年斑中主要的神经毒性成分是由39-43个氨基酸组成的β淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)。目前,有关Aβ及其有效片段如Aβ25-35、Aβ31-35的神经毒作用己有广泛报道,故一般认为,AD的发病与Aβ在脑内的沉积以及由此产生的神经毒性作用有关。然而,Aβ发挥神经毒性作用的细胞和分子机制很复杂,迄今为止还不十分清楚,也还缺乏有效的针对Aβ的抗AD药物。精氨酸加压素(Arginine vasopressin, AVP)作为神经递质主要由视交叉上核、床纹终核、杏仁核和室旁核的神经分泌小细胞所产生,是9个氨基酸构成的多肽。AVP的生理作用较广泛,在外周血中以激素形式主要调节体内水电解质平衡及调节血压,在中枢神经系统以神经递质或神经调质可以影响和调节脑的高级功能如学习和记忆。有研究表明,AD患者脑内和血浆内AVP水平与正常人相比有明显减少,这提示AD的发病可能与AVP在脑和血浆中的水平下降有关。此外AVP对老年人记忆的改善已有临床报道,提示AVP可能具有对抗Ap神经毒性的作用,在防治AD、改善记忆障碍方面可能发挥重要作用。然而,迄今为止关于AVP在神经保护作用的行为学和电生理研究方面仍然存在分歧：此外,虽然有实验表明Aβ能够损害大鼠学习和记忆功能,AVP可能与之相反,但AVP是否能够逆转或部分拮抗Aβ对认知功能的伤害至今仍未见报道。因此,本实验的目的主要是利用行为学实验手段进一步确定脑室内注射AVP是否能影响大鼠的空间学习和记忆能力,特别是AVP的预处理是否能够保护学习记忆功能免受Aβ的伤害。同时,我们还采用分子生物学和电生理手段检测了海马组织磷酸化Ca2+／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(p-CaMKⅡ)的表达水平以及海马神经元的放电频率,以探讨AVP发挥神经保护效应的细胞和信号转导机制。本研究进行了如下三部分工作：(1)利用国际公认的经典的Morris水迷宫测试手段,检测了侧脑室注射AVP对Aβ25-35损害大鼠空间学习和记忆能力的拮抗效应；(2)利用Western blot技术检测了Aβ25-35.和AVP对大鼠海马组织p-CaMKⅡ表达水平的影响；(3)利用多通道细胞外记录和锋电位分类技术,观察了侧脑室注射Aβ25-35和AVP对大鼠在体海马CA1区神经元自发放电活动类型及频率的影响,以及AVP对Aβ影响海马神经元自发放电活动的调制作用。由此,本研究从细胞、分子到行为学三个水平探讨了AVP对抗Aβ神经毒性作用的生物学效应及其机制,旨在为AD的发病机制以及AD的防治提供可能的新思路。目的：本实验通过使用Morris水迷宫方法探讨AVP对抗Aβ所致大鼠空间学习、记忆功能伤害的神经保护作用。方法：实验取运动灵活、无视力障碍的成年雄性Wistar大鼠(230-250g)随机分为对照组、Aβ25-35组、不同浓度AVP组、以及AVP和Aβ25-35联合给予组,每组10只。行Morris水迷宫定位航行和空间探索实验,分别测定大鼠空间定位学习和记忆能力。主要指标包括大鼠寻找平台的平均逃避潜伏期和游过距离、撤除平台后大鼠在目标象限游泳时间和游过距离占游泳总时间或总距离的百分比。同时,测定各组大鼠的游泳速度和视力,以除外运动和视力障碍对测定指标的影响。结果：(1)对照组大鼠逃避潜伏期在训练的第1、2、3、4、5天分别为73.7±6.5s,55.4±10.1s,28.9±7.5s,11.2±2.3s和9.5±1.2s；大鼠找到平台所游过距离分别为1799.9±242.6cm,1723.7±143.8 cm,677.5±176.4 cm,273.6±53.7cm和223±29.3 cm；撤除平台后动物在目标象限所花时间占游泳总时间的百分比为49.3±0.3%；目标象限内游过距离占总距离的百分比为49.6±0.2%。(2)脑室注射AP25-35 (25 nmol)显著降低了大鼠的空间学习和记忆能力,与对照组相比,平均逃避潜伏期和游泳距离两个指标在各时间点均明显延长(P<0.01)；撤除平台后动物在目标象限所花时间占游泳总时间的百分比减少至35.1±0.3%,,游过距离占总距离的百分比也减少至35.1±0.2%,与对照组相比显著缩短(P<0.01)。(3)给予低剂量(0.1 nmol/5ul)的AVP后,学习、记忆功能轻度提高,但与对照组比较,无统计学差异(P>0.05)；给予中等剂量(1 nmol/5ul)和高剂量(10 nmol/5ul) AVP后,大鼠定位航行与空间探索能力均明显增强(P<0.01)平均逃避潜伏期和找到平台所游过的距离均明显缩短(P<0.01)。撤除平台后,1 nmol组动物在目标象限所花时间占游泳总时间的百分比较对照组增加到57.9±0.03%,游过距离占总距离的百分比增加到58.1±0.04%(P<0.01); 10 nmol组动物分别增加为67.6±0.02%和67.1±0.04%(P<0.01)。(4)联合给予AVP和Aβ25-35后,不同剂量的AVP对Aβ25-35所致的定向航行和空间探索能力均显示出一定的剂量依赖性保护效应。在0.1 nmol组,AVP对Aβ25-35的行为学伤害未显示出明显的改善(P>0.05)；用1 nmol和10 nmol AVP处理后,平均逃避潜伏期和寻找平台距离明显小于单独使用Aβ25-35组(P<0.05),空间探索实验则显示：联合给药的1 nmol和10 nmol AVP组.在目标象限所花时间和游过距离占游泳总时间或距离的百分比较单独使用Aβ25-35组明显增加(P<0.01),1 nmol组分别为46.8±0.01%和47.1±0.02%；10 nmol组分别为52.2±0.02%和52.3±0.04%。(5)可视平台测试结果显示,与对照组相比,各处理组大鼠游泳速度和视力没有明显区别(P>0.05),表明大鼠的运动功能和视力没有受到所给药物的影响。结论：脑室内注射Aβ25-35能够明显伤害大鼠空间定位的学习和记忆功能；脑室内单独给予AVP (1 nmol和10 nmol)能够在一定程度上提高大鼠学习和记忆能力,而AVP预处理能够有效对抗Aβ25-35引起的大鼠空间学习记忆损伤,显示出一定的剂量依赖性神经保护效应。提示中枢AVP系统活动的上调可能对阿尔茨海默病的预防和治疗具有积极的作用。第二部分精氨酸加压素和Aβ25-35对大鼠海马CaMKⅡ磷酸化水平的影响目的：本实验使用Western blot技术检测了慢性侧脑室注射Aβ25-35和AVP对大鼠海马神经细胞质膜上磷酸化Ca2+／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(phosphorylated Ca2+ /calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, p-CaMKⅡ)表达的影响,以揭示AVP在行为学上对抗Aβ的神经保护效应机制。方法：行为学结束后,四组大鼠(对照组、Aβ25-35组、AVP组、以及AVP和Aβ25-35联合给予组)断头处死,取脑并分离出海马,组织进行超声匀浆、提取蛋白,然后采用Westernblot检测海马神经元质膜上p-CaMKⅡ的表达。结果：(1)对照组大鼠海马神经细胞质膜上p-CaMKⅡ表达量的平均灰度值为0.601±0.01(n=7)。(2)与对照组相比,给予10 nmolAVP后大鼠海马神经细胞质膜上p-CaMKⅡ的表达量增加,平均灰度值为0.747±0.02,(n=7；P<0.01)。(3)与对照组相比,给予Aβ25-35(25nmol/5ul)后大鼠海马神经细胞质膜上p-CaMKⅡ的表达量下降,平均灰度值为0.48±0.03(n=7；P<0.01)。(4)与单独给予Aβ25-35组相比,AVP和Aβ25-35合用后大鼠的海马神经细胞质膜上p-CaMKⅡ的表达量有所增加,平均灰度值为0.593±0.02(n=7；P<0.01)。结论：脑室注射AVP能够提高海马神经细胞质膜上p-CaMKⅡ的表达；脑室注射Aβ25-35能够抑制海马神经细胞质膜上p-CaMKⅡ的表达；AVP预处理能够在一定程度上对抗Aβ25-35对海马神经细胞质膜上p-CaMKⅡ表达量的抑制作用。这提示Aβ和AVP对大鼠学习、记忆行为学的影响可能与海马磷酸化CaMKⅡ的表达量有密切关系。第三部分：精氨酸加压素保护大鼠在体海马神经元自发放电免受Aβ25-35的伤害目的：本实验通过使用多电极细胞外记录技术,观察慢性侧脑室内注射AVP或Aβ25-35以及两者联合应用对大鼠在体海马CA1区神经元自发放电的影响,旨在为AVP对抗Aβ的神经保护效应寻找电生理机制。方法：实验采用雄性Wistar大鼠,麻醉后将其固定在脑立体定位仪上,将三根绑定的金鼠记录电极精确插入一侧海马CA1(前囟后3.0-3.8mm,中线旁2.5-3.0mm,深2.5-3.5mm)。然后打开放大器,开始观察并记录各处理组大鼠的在体胞外自发性单单位放电的模式和放电频率。记录的数据通过利用Spike sorting技术和Matlab软件进行分析。结果：(1)在海马CA1区共记录到三种类型的放电,即快速连续型、慢而不规则型和爆发型(Burst)。对照组大鼠海马CA1区神经元的平均放电频率为7.2±0.81 Hz(n=81)。(2)与对照组大鼠相比,Aβ25-35组大鼠的海马CA1区神经元放电频率降低到4.6±0.72 Hz(n=72,P<0.01)。(3)与对照组相比,AVP组大鼠的海马CA1区神经元放电频率增加到7.9±0.63Hz(n=83,P<0.05)。(4)与单独给予Aβ25-35组相比,AVP预处理后,海马CA1区神经元放电频率增加到5.3±0.61 Hz(n=75,P<0.05)。结论：Aβ25-35抑制了海马神经元的自发放电,而AVP能提高并且一定程度上对抗Aβ25-35对自发放电的伤害,提示大量单个细胞的放电和神经元环路活动的改变可能部分地反映了脑高级功能活动改变的信息。

全文目录

Abstract(in Chinese)  5-9
Abstract(in English)  9-13
Part Ⅰ:Arginine Vasopressin Prevents Against Aβ25-35-Induced Impairmentof Spatial Learning and Memory in Rats  13-34
  Abstract  13
  Introduction  13-15
  Materials and Methods  15-16
  Results  16-28
  Discussion  28-30
  References  30-34
Part Ⅱ:Effects of Arginine Vasopressin and Aβ25-35 on PhosphorylatedCaMKII in Rat Hippocampus  34-45
  Abstract  34
  Introduction  34-36
  Materials and Methods  36-37
  Results  37-40
  Discussion  40-41
  References  41-45
Part Ⅲ:Arginine Vasopressin Protects Against Aβ25-35 Induced Suppressionof Spontaneous Discharges in Hippocampal CA1 Region  45-61
  Abstract  45
  Introduction  45-46
  Materials and Methods  46-47
  Results  47-58
  Discussion  58-59
  References  59-61
综述  61-69
个人简介  69-70
致谢  70

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