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金属蛋白MT的电化学行为以及金属蛋白p53与DNA相互作用的研究

作　者: 李雪
导　师: 王建秀
学　校: 中南大学
专　业: 分析化学
关键词: 金属硫蛋白 Nafion-汞膜修饰电极 p53 DNA 荧光
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

金属蛋白是由氨基酸和金属离子结合而成的。金属离子作为金属蛋白中重要的辅因子,承担着活性中心或结构中心的作用。金属硫蛋白与癌症抑制转录因子p53是两种重要的金属蛋白。金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一类低分子量,高半胱氨酸含量,能结合大量重金属离子的蛋白质。MT广泛存在于人体、动物、植物以及微生物体内,它参与必需金属的平衡代谢和重金属解毒过程。MT电化学行为的研究对阐述氧化还原诱导的MT电子转移与金属释放过程以及环境毒理学方面的作用具有重要意义。到目前为止,MT电化学行为的研究几乎都是在汞电极上进行的,由于MT与汞之间较强的结合力,MT中的Cd和Zn离子有可能被汞所取代。此外,汞电极的机械强度差且容易产生污染。引入具有选择性渗透作用的Nafion膜,有望克服上述缺陷。本文采用新型的Nafion-汞膜修饰电极(NCMFEs)对两种形态的MT,即Zn7-MT和CdT-MT进行了定量研究。分别在-1.141和-0.774 V处观察到Zn7-MT和Cd7-MT的氧化还原峰。结合电化学和原子吸收计算出电极表面每个MT分子中具有电活性的金属-巯基(M-Cysteine, M=Zn,Cd)侧链的数量分别为2.03和0.62。表明在一个MT分子中,并不是所有金属-半胱氨酸侧链都参与氧化还原反应,只有距离电极表面较近的基团才能够参与电子转移过程。上述工作对于阐述MT在环境毒理学和细胞内金属转移过程的机制具有重要的作用。肿瘤抑制转录因子p53在遏止肿瘤细胞生长、DNA修复、以及细胞程序化凋亡等方面扮演着十分重要的角色,因而有“基因组卫士”的美称。p53是一种结合Zn离子的蛋白质,其生物学功能和与DNA键合的特性有关。p53蛋白质中与DNA键合的区域含有一个锌指结构,锌指结构中锌离子对于维持野生型p53(没有发生突变的型体)的构型、稳定性及其与DNA的键合活性至关重要。目前常见的检测p53与DNA相互作用的方法有凝胶迁移滞后法、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、以及电化学等。与上述方法相比,荧光分析法是一种简单、有效且灵敏的检测手段。通过引入能嵌入DNA螺旋中的荧光染料探针,检测了p53与DNA相互作用。另外,通过荧光共振能量转移(FRET),其中p53作为供体,DMACA修饰的DNA作为受体,来指示p53与DNA之间的相互作用。上述方法对灵敏、简便地检测p53与DNA的相互作用过程提供了重要依据。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
第一章绪论  9-28
  1.1 金属蛋白的分类及其生物学功能  9-10
  1.2 MT的定义与分类  10-11
  1.3 MT的理化性质与结构  11-14
    1.3.1 MT的理化性质  11
    1.3.2 MT的一级结构  11-12
    1.3.3 MT的空间结构  12-14
  1.4 MT与金属结合的特异性  14-16
  1.5 MT的检测方法  16-20
    1.5.1 间接方法  16
    1.5.2 直接方法  16-20
  1.6 p53的结构  20-21
    1.6.1 p53的结构  20
    1.6.2 p53的DNA键合区域(p53DBD)的结构  20-21
  1.7 锌指蛋白的定义及功能  21-23
    1.7.1 锌指蛋白的定义及分类  21-22
    1.7.2 锌指蛋白的功能  22
    1.7.3 锌指蛋白中的锌离子的功能  22-23
  1.8 锌离子在p53中的作用  23-24
  1.9 p53的生物学功能  24-25
    1.9.1 细胞的保护者  24
    1.9.2 管生成抑制作用  24
    1.9.3 DNA修复  24-25
    1.9.4 p53的其它生物学功能  25
  1.10 常用的检测p53与DNA之间相互作用的方法  25-27
  1.11 本论文的研究背景与意义  27-28
第二章 NAFION-汞膜修饰电极上金属硫蛋白的电化学行为研究  28-40
  2.1 引言  28-30
  2.2 实验部分  30-32
    2.2.1 化学试剂  30
    2.2.2 仪器设备  30-31
    2.2.3 溶液的配制  31
    2.2.4 操作步骤  31-32
  2.3 结果与讨论  32-38
    2.3.1 实验流程图  32-33
    2.3.2 Cd_7-MT的表征  33-34
    2.3.3 Nafion-汞膜修饰电极上Zn_7-MT和Cd_7-MT的伏安响应  34-36
    2.3.4 每个MT分子中具有氧化还原活性的金属-巯基数的定量分析  36-38
  2.4 小结  38-40
第三章利用嵌入DNA螺旋中的荧光探针研究P53与DNA的相互作用  40-55
  3.1 引言  40-42
  3.2 实验部分  42-45
    3.2.1 实验试剂  42-43
    3.2.2 仪器设备  43-44
    3.2.3 溶液的配制  44
    3.2.4 实验操作步骤  44-45
      3.2.4.1 不同pH值的吖啶橙(AO)配制  44
      3.2.4.2 不同浓度的AO溶液的配制  44
      3.2.4.3 配制AO与SLS的混合溶液  44
      3.2.4.4 配制AO-双链DNA-p53混合溶液  44-45
  3.3 结果与讨论  45-51
    3.3.1 最佳pH值的选择  45-46
    3.3.2 最佳浓度的选择  46
    3.3.3 AO与SLS混合溶液的检测  46-47
    3.3.4 AO-双链DNA-p53混合体系的荧光光谱检测  47-48
    3.3.5 非一致性ds-DNA-AO-p53体系的研究  48-49
    3.3.6 噻唑橙(TO)-DNA-p53体系荧光光谱检测  49-51
  3.4 小结  51
  3.5 展望  51-55
第四章结论  55-56
参考文献  56-65
致谢  65-66
攻读硕士学位期间主要的研究成果  66

金属蛋白MT的电化学行为以及金属蛋白p53与DNA相互作用的研究

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