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利用人工油体和植物油体表达人表皮细胞生长因子hEGF
作 者: 赵宏
导 师: 刘昱辉
学 校: 中国农业科学院
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人工油体 植物油体表达体系 人表皮细胞生长因子
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 89次
引 用: 2次
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内容摘要
人表皮细胞生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)是存在于唾液、胃液、血液、尿液中的一种分泌肽,由53个氨基酸组成,分子量为6221Da,等电点为4.6,对热稳定,根据分泌方式可分为旁分泌和自分泌两种。人表皮细胞生长因子含3个分子内二硫键,这3个二硫键对其结构稳定和功能发挥起重要作用。hEGF与其受体的相互作用,介导了细胞内一系列至关重要的生理功能,调控细胞增殖、分化、迁移、生存等与细胞命运密切相关的过程,在细胞发育、伤口愈合、器官发育中发挥重要作用。hEGF在促进伤口和溃疡愈合方面具有显著作用,因此被广泛应用于医药和化妆品领域,但hEGF组织提取和化学合成都存在严重的不足,目前临床上应用的hEGF主要是利用基因工程表达和生产的。植物油体表达体系的原理是将目的蛋白的编码基因插在油体膜蛋白OLEOSIN基因的3’端,编码OLEOSIN-目的蛋白的基因会在转基因植物种子的油体上特异表达,利用油体亲脂疏水的特性,转基因植物种子经简单的粉碎-离心-回收上层油相-去油,即可获得重组的油体蛋白。植物油体表达体系具有融合蛋白易于分离,提取工艺简单,重组蛋白可在种子中长期稳定贮存、易于运输,无动物病毒污染,蛋白后修饰系统完善等诸多优点。国内外已利用该体系在转基因植物种子中表达了GUS、载脂蛋白A1,胰岛素和降钙素等。但植物油体表达体系作为植物生物反应器,仍然受到植物生长周期长的限制。近年来人们发现,油体的三个组成成分TAGs,PLs和OLEOSIN-s,可在体外重组形成稳定的人工油体,人工油体在结构和稳定性上与植物来源的油体无显著差别。将目的蛋白编码基因插入oleosin的3’端,在大肠杆菌中表达的重组OLEOSIN-目的蛋白,与磷脂和三酰甘油在体外重组形成人工油体,利用重组人工油体相经简单离心即可与水相分开的特性,可以实现目的蛋白的快速分离。人工油体表达系统的主要优点是目的蛋白生产周期短、蛋白易于纯化,可用于乳化剂和固定化酶生产等,但一方面该系统缺少蛋白后加工修饰系统,另一方面OLEOSIN是一种碱性、强疏水蛋白,OELOSIN与目的蛋白重组形成的新融合蛋白能否具有生物学功能,能否在E.coli中成功表达,并在体外重组形成人工油体,人工油体与植物油体是否有差异等均尚需实验研究。为此本论文以hEGF为目的蛋白,研究利用人工油体表达系统和植物油体表达系统,表达和生产目的蛋白的可行性,主要内容和结果包括:(1)按照植物偏爱密码子人工合成了hEGF的编码基因; (2)构建了3个hEGF的E.coli表达载体:hEGF/pET32a、OLEOSIN-hEGF/pET28a、OLEOSIN-hEGF/pET32a;构建了1个植物油体表达载体pESCV2301;(3) SDS-PAGE和Western分析发现:a. hEGF/pET32a [Rosetta-gamiTM2(DE3) pLysS ] IPTG诱导后,可检测到目的蛋白的表达,表达的hEGF蛋白主要以可溶形式存在; b. OLEOSIN-hEGF/pET28a[Rosetta 2(DE3)] IPTG诱导后,未检测到目的蛋白的表达;c. OLEOSIN-hEGF/pET32a[Rosetta-gamiTM2(DE3)pLysS]IPTG诱导后,可检测到OLEOSIN-hEGF融合蛋白的表达,表达的蛋白主要以包涵体形式存在。(4)利用AKATA亲和层析,分离获得hEGF蛋白,蛋白纯度大于80%,MTT法“细胞增殖实验”结果表明表达的hEGF蛋白可显著促进细胞增殖,具有生物学活性,活性与Sigma公司销售的hEGF基本相同;(5)人工油体体外重组实验结果表明E.coli中表达OLEOSIN-hEGF融合蛋白可在pH7.5的磷酸钠缓冲液中与橄榄油、磷脂酰胆碱重组形成油体,显微镜检发现,重组油体与油菜中提取获得的油体在结构,稳定性上无显著差别;(6)用农杆菌介导法,将OLEOSIN-hEGF融合蛋白基因转入油菜中双4号,获得转基因油菜3株,转基因油菜的分子检测正在进行,收获种子后可对转基因油菜中和E.coli中表达的OLEOSIN?hEGF进行各项比较。
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全文目录
摘要 6-8 Abstract 8-14 第一章 综述 14-28 1.1 人表皮细胞生长因子 14-21 1.1.1 人表皮细胞生长因子的特性 14-17 1.1.2 人表皮细胞生长因子的生物生理活性及其应用 17-19 1.1.3 人表皮细胞生长因子的制备 19-20 1.1.4 EGF 的发展前景 20-21 1.2 油体及油体膜蛋白 21-23 1.2.1 植物油体及油体膜蛋白的形态学和功能 21-22 1.2.2 油体的形成过程 22-23 1.3 油体及油体蛋白的应用 23-28 1.3.1 油体用作乳化剂 23-24 1.3.2 植物油体表达体系 24-25 1.3.3 人工油体技术 25-28 第二章 材料与方法 28-37 2.1 材料 28-29 2.1.1 植物材料、载体与菌株 28 2.1.2 试剂盒 28-29 2.1.3 药品试剂 29 2.1.4 实验仪器 29 2.1.5 引物 29 2.2 实验方法 29-37 2.2.1 非融合蛋白原核表达载体的构建 29-32 2.2.2 原核油体蛋白融合表达载体的构建 32-33 2.2.3 带有重组质粒的 E.coli 菌株的获得 33 2.2.4 在大肠杆菌中的诱导表达 33-34 2.2.5 融合蛋白的 Western 分析 34 2.2.6 不含油体蛋白的重组hEGF 的纯化 34 2.2.7 油菜油体提取与人工油体的构建 34-35 2.2.8 EGF 的生物活性分析 35 2.2.9 OLEOSIN-hEGF 融合蛋白植物表达载体的构建与转化 35-37 第三章 结果与讨论 37-69 3.1 HEGF 的 E.COLI 表达载体的构建 37-43 3.1.1 CBD 基因的扩增与pCBDT 的构建 39-41 3.1.2 hEGF 的 E.coli 表达载体的构建 41-43 3.2 OLEOSIN-HEGF 的 E.COLI 表达载体的构建 43-53 3.2.1 E.coli 表达载体 OLEOSIN-hEGF/pET32a 的构建 43-49 3.2.2 E.coli 表达载体 OLEOSIN-hEGF/pET28a 的构建 49-53 3.3 原核表达载体的诱导表达 53-55 3.3.1 hEGF 在大肠杆菌中诱导表达 53 3.3.2 OLEOSIN-hEGF 在大肠杆菌中诱导表达 53-54 3.3.3 目标蛋白存在形式的分析 54-55 3.4 融合蛋白的生物信息学分析 55 3.5 HEGF 目的蛋白的亲和纯化 55-56 3.6 融合蛋白的 WESTERN 分析 56-57 3.7 重组油体的构建 SDS-PAGE 分析及镜检 57-58 3.7.1 融合蛋白人工油体的构建 57 3.7.2 人工油体的显微镜分析 57-58 3.8 生物活性分析 58-59 3.9 OLEOSIN-HEGF 融合蛋白的植物表达载体的构建与遗传转化 59-66 3.9.1 植物油体表达载体的构建 59-60 3.9.2 植物油体表达载体的遗传转化 60-66 3.10 讨论 66-69 3.10.1 基因设计和载体构建 66 3.10.2 融合蛋白的表达 66-67 3.10.3 利用表达的融合蛋白在体外重组形成人工油体 67 3.10.4 重组人工油体在包涵体复性领域的应用 67-69 第四章 全文结论 69-70 参考文献 70-76 致谢 76-77 作者简历 77
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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