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ROCK抑制剂Y-27632对角膜上皮的保护性作用及其机制的初步研究

作　者: 李斌
导　师: 史伟云
学　校: 济南大学
专　业: 眼科学
关键词: ROCK抑制剂 Y-27632 NOX4 ROS 氧化应激
分类号: R772.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：建立H2O2诱导的小鼠TKE2细胞和角膜氧化应激的体内外模型，通过添加ROCK抑制剂Y-27632，研究Y-27632对角膜上皮的保护性作用及其机制。方法：（1）应用小鼠角膜上皮干/祖细胞系（TKE2）作为细胞模型，用无BPE（牛垂体提取物）的培养基处理2小时，而后用含Y-27632的培养基预干预2小时，再用200μM H2O2处理2小时，24小时后检测细胞内ROS（活性氧自由基）水平、细胞增殖以及NOX4、NRF2的表达情况；收集细胞提取mRNA，定量PCR检测NRF2下游基因的表达情况；（2）选择6-8周龄Balb/C小鼠，随机分为4组，1组为对照组，另外3组采用5μl500μM H2O2角膜局部处理30分钟，而后分别采用PBS（磷酸盐缓冲液）、BSA（牛血清白蛋白）或Y-27632进行干预；一组4小时后取材，二组12小时后再次给予PBS、BSA或Y-27632干预，24小时后取材，分别行ROS、TUNEL、NOX4、NRF2的免疫荧光染色及H.E染色。结果：Y-27632干预可以显著抑制H2O2诱导的小鼠TKE2细胞和小鼠角膜的氧化应激反应，并呈现典型的时间效应。作用机制包括以下几点：（1）Y-27632通过抑制H2O2诱导的NOX4的表达上调，降低了细胞在H2O2诱导下ROS水平的过度累积（；2）Y-27632抑制了H2O2诱导的NRF2通路的活化，以及下游HO-1、NQO-1、catalase等因子的过度表达，从而避免了NRF2信号通路过度活化引起的细胞应激反应。结论：ROCK抑制剂Y-27632主要通过抑制NOX4表达和NRF2信号通路过度活化，降低细胞内ROS水平，从而起到保护角膜上皮细胞的作用。

全文目录


导师简介  5-8
摘要  8-9
Abstract  9-10
主要符号表  10-11
引言  11-13
第一章 材料和方法  13-25
  1.1 实验材料  13-17
    1.1.1 实验细胞和动物  13
    1.1.2 实验仪器  13-14
    1.1.3 实验耗材  14-15
    1.1.4 实验试剂  15-16
    1.1.5 主要溶液配制  16-17
  1.2 TKE2 细胞氧化应激模型建立及检测  17-22
    1.2.1 小鼠角膜缘上皮干/祖细胞系（TKE2）的传代培养  17
    1.2.2 TKE2 细胞氧化应激模型的建立  17
    1.2.3 细胞形态学观察  17-18
    1.2.4 细胞的增殖检测  18
    1.2.5 细胞内 ROS 水平检测  18
    1.2.6 细胞免疫荧光染色检测  18-19
    1.2.7 细胞内 NRF2-ARE 下游基因表达水平检测  19-22
  1.3 小鼠角膜氧化应激模型的建立及检测  22-25
    1.3.1 小鼠角膜氧化应激模型的建立  22
    1.3.2 小鼠角膜氧化应激模型的裂隙灯检查  22
    1.3.3 角膜切片的 TUNEL 荧光染色  22-23
    1.3.4 角膜切片的 ROS 水平检测  23
    1.3.5 角膜切片的组织病理学检查  23-24
    1.3.6 角膜切片的免疫荧光检测  24-25
第二章 结果  25-32
  2.1 细胞检测结果  25-28
    2.1.1 形态学观察  25
    2.1.2 细胞增殖活性  25-26
    2.1.3 细胞内 ROS 水平检测  26-27
    2.1.4 细胞 NOX4、NRF2 免疫荧光检测  27
    2.1.5 NRF2-ARE 下游基因表达水平检测  27-28
  2.2 角膜组织检测结果  28-32
    2.2.0 裂隙灯检查  28-29
    2.2.1 组织病理检查  29
    2.2.2 TUNEL 凋亡染色  29-30
    2.2.3 NOX4 免疫荧光染色  30
    2.2.4 ROS 检测  30-31
    2.2.5 NRF2 免疫荧光染色  31-32
第三章 讨论  32-34
第四章 结论  34-35
参考文献  35-39
综述  39-55
  参考文献  46-55
攻读学位期间撰写的论文  55-56
致谢  56

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 眼纤维膜疾病 > 角膜疾病
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