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SiRNA下调bFGF基因对肺腺癌A549影响的相关性研究

作　者: 张亚琨
导　师: 郭其森
学　校: 济南大学
专　业: 肿瘤学
关键词: NSCLC 肺腺癌A549细胞株 SiRNA干扰 bFGF 紫杉醇敏感性
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的与背景：肺癌是世界上最常见的癌症，肺癌可分为两大类：非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），NSCLC （Non-small-cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌病例的80%～85%，非小细胞肺癌已成为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。肺癌病死率无论男女均占恶性肿瘤病死率的第一位，严重威胁人类健康。近年来，随着分子生物学和药理学的不断发展，NSCLC的综合治疗及个体化治疗已取得明显进步，然而由于肿瘤耐药的出现，使得绝大部分肿瘤化疗后很快出现复发或转移，从而限制了许多化疗药物例如紫杉醇等抗肿瘤药物在NSCLC治疗的临床应用。bFGF在体内分布非常广泛，其生物学行为呈多样性和多效性分布。bFGF主要存在低亲和力受体和亲和力受体两类，分别为肝素受体和酪氨酸蛋白激酶受体;不同组织细胞FGF受体表达特异性。目前研究证实在肿瘤细胞的生长、生存、凋亡和在新生血管的FGFs-FGFRs信号通路的异常活化有关联并参与其过程。研究表明，肺癌患者血清bFGF含量和患者预后密切相关，血清含量高者预后较差。过往研究发现bFGF参与病理和生理的新生血管的机制相关［5］，推测bFGF不仅在肺癌的发生、发展、浸润、转移过程中发挥着重要作用，还有机体的耐药性有关。构建靶向bFGF的siRNA，以脂质体为载体介导bFGF siRNA转染肺腺癌细胞株A549，利用实时荧光定量逆转录一聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reacti, RT-PCR）检测bFGF siRNA干扰下调前后细胞内bFGF的mRNA含量，筛选转染下调最显著的siRNA序列；利用蛋白质免疫印迹检测技术（western blot analysis, Western blot）检测bFGF siRNA干扰下调前后肺腺癌A549细胞内bFGF蛋白水平变化。应用MTT法即标准比色法检测bFGF siRNA干扰下调前后肿瘤细胞内bFGF的表达水平与紫杉醇药物敏感性的关系，为临床个体化治疗提供理论依据。方法：应用PUBMED查寻bFGF基因序列，NM₀02006.4,采用人工合成siRNA序列,同时以negative siRNA作为对照，能够用脂质体Lipofectamine2000为载体将bFGF siRNA导入肺腺癌A549细胞进行瞬时转染，对bFGF siRNA干扰下调前后肺腺癌A549细胞提取总RNA及总蛋白，应用RT-PCR技术对siRNA干扰下调前后肺腺癌A549细胞的bFGF mRNA进行定量分析，筛选出转染效率高的siRNA序列。再利用筛选的siRNA序列干扰下调肺腺癌A549细胞，步骤同前，Westen-blot法检测干扰下调后肺腺癌A549细胞中bFGF蛋白水平的表达。MTT比色法检测干扰下调前后肺腺癌A549细胞对紫杉醇药物敏感性的变化。应用流式细胞仪检测干扰下调后肺腺癌A549细胞凋亡和细胞周期的变化。结果：RT-PCR结果显示bFGF siRNA干扰下调后肺腺癌A549后bFGF基因水平表达降低，其中bFGF siRNA-2基因序列转染下调效率最高；Western blot检测结果显示siRNA-1干扰下调肺腺癌A549细胞后其bFGF蛋白表达水平较干扰下调前显著降低。MTT比色法检测干扰下调前后肺腺癌A549细胞对紫杉醇药物敏感性，结果显示干扰下调前后细胞对紫杉醇的抑制率较对照组显著增高（P<0.05）。流式细胞仪细胞凋亡检测显示：bFGF siRNA+紫杉醇组凋亡细胞比例较controlsiRNA组、control siRNA+紫杉醇组、bFGF siRNA组明显增加（P<0.05）。细胞周期检测显示control siRNA+紫杉醇组和bFGF siRNA+紫杉醇组G2/M期细胞百分率高于control siRNA组和bFGF siRNA组，差异有统计学意义（P<0.05）结论：干扰下调bFGF可以降低bFGF基因表达水平，增加了肺腺癌A549细胞对紫杉醇药物的敏感性，促进紫杉醇诱导的凋亡和抑制细胞生长。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
主要符号表  12-14
前言  14-16
1、材料与方法  16-28
  1.1 仪器与试剂  16-17
  1.2 实验主要方法  17-28
2、结果  28-34
  2.1 bFGF siRNA 转染干扰对肺腺癌 A549 细胞 bFGF mRNA 表达的影响  28-29
  2.2 bFGF siRNA 转染干扰对肺腺癌 A549 细胞 bFGF 蛋白表达的影响  29
  2.3 bFGF 干扰下调增加肺腺癌 A549 细胞对紫杉醇的敏感性  29-31
  2.4 bFGF 下调增加肺腺癌 A549 细胞紫杉醇诱导的凋亡  31-32
  2.5 bFGF siRNA 转染干扰后检测紫杉醇对肺腺癌 A549 细胞的细胞周期影响  32-34
3、讨论  34-37
4、结论  37
参考文献  37-40
综述  40-48
  参考文献  46-48
攻读硕士学位期间发表的文章  48
攻读硕士学位期间参与课题  48-49
致谢  49

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