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MSCs瘤化发生过程中STAT3过度激活规避研究

作　者: 白璐
导　师: 朱静
学　校: 重庆医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 肿瘤微环境 STAT3 规避瘤化
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的探讨肿瘤微环境下骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）瘤样转化与信号转导和转录激活子3（Signal Transducer andActivator of Transcription3，STAT3）过表达的相互关系；利用STAT3特异性抑制剂STA-21处理来明确抑制STAT3过表达是否可降低肿瘤微环境下MSCs瘤样转化的风险；进而为规避肿瘤微环境下MSCs的恶性转化提供科学依据，使其更加安全地应用于临床。材料与方法1.细胞培养：人乳腺癌细胞MCF-7B及大鼠C6胶质瘤细胞用DMEM/F12完全培养基培养；无菌条件下原代分离出大鼠股骨，用不完全培养基冲洗骨髓腔后，转为DMEM/F12完全培养基培养细胞沉淀。2.实验分组：本实验分两部分。第一部分实验分5组。空白组：单独培养的MCF-7B；对照组：加含0.1%DMSO于培养基中的MCF-7B；实验组：同空白组外，根据向培养基内加入STA-21浓度不同分为三个不同浓度亚组；第二部分实验仍设为5组。空白组：单独培养的MSCs；对照组：将MSCs培养在含0.1%DMSO的6孔板内，结合插入式培养皿与C6构建间接共培养体系；实验组：同对照组外，根据向6孔板加入STA-21浓度不同分为三个不同浓度亚组。3.实验方法：1）利用倒置相差显微镜观察细胞形态变化。2）MTT法检测细胞增殖情况。3）流式细胞术检测细胞周期及凋亡。4）实时荧光定量PCR检测MSCs肿瘤相关基因MDM2、 STAT3、CyclinD1、Bcl-xl mRNA的相对表达量。5）Western blot检测各组MCF-7B P-STAT3、STAT3、CyclinD1及Bcl-xl蛋白的表达，检测各组MSCs共培养7d后MDM2、STAT3，P-STAT3、CyclinD1及Bcl-xl蛋白的表达。结果1）细胞形态随着STA-21药物浓度的增加，MCF-7B细胞出现增殖受抑及调亡增加，细胞形态皱缩，镜下可见大量死亡的MCF-7B细胞；MSCs与C6间接共培养7d后，对照组细胞形态发生明显改变，胞核变小，胞质向胞核中央缩小，细胞变为长梭形。实验组细胞随着STA-21药物浓度的增加，MSCs形态更趋一致，细胞形态同空白组近似。2）MTT法检测细胞增殖效应MTT结果显示MCF-7B细胞经不同浓度STA-21作用24h后，细胞增殖抑制率与空白组比较及组间比较均有统计学差异（P<0.01）；对照组MCF-7B细胞增殖抑制率与空白组接近（P>0.05）；第二部分实验中对照组MSCs增殖率明显高于空白组（P<0.05）,实验组MSCs经各浓度STA-21（10、20、30μΜ）作用7d后，能够显著抑制MSCs过度增殖，且随着STA-21作用浓度的增加，其抑制MSCs增殖的效应也不断增强，呈现一定的浓度依赖性。3）流式细胞术检测细胞凋亡流式细胞结果显示空白组MCF-7B细胞的凋亡率与对照组MCF-7B的凋亡率接近，二者无显著差异（P>0.05）；实验组MCF-7B经各浓度STA-21作用24h后，细胞凋亡率明显增加，与空白组比较及组间比较具有显著差异（P<0.01），提示STA-21可促进MCF-7B细胞凋亡并呈浓度依赖性。4）流式细胞术检测细胞周期细胞周期分析结果显示，随着STA-21作用浓度的增加，MCF-7B细胞G1期比例逐渐增高，较空白组明显增高（P<0.05）。表明STA-21可引起MCF-7B细胞周期阻滞于G1期，从而导致细胞增殖能力下降。5）实时荧光定量PCR检测5组MSCs肿瘤相关基因MDM2、STAT3、CyclinD1、Bcl-xl mRNA的相对表达量结果显示，与空白组MSCs相比，对照组高表达MDM2、STAT3、CyclinD1、Bcl-xl mRNA（P<0.05）；实验组STA-2110组MDM2、CyclinD1、Bcl-xl mRNA表达量较空白组增高（P<0.05）；其余各实验组MDM2、 CyclinD1、Bcl-xl mRNA表达量接近空白组（P>0.05）；STAT3mRNA表达量3个实验组与空白组接近（P>0.05）。6）Western blot检测结果MCF-7B细胞经不同浓度STA-21处理24h后，与空白组相比STA-21可明显抑制MCF-7B细胞P-STAT3蛋白的表达（P<0.01），并下调CyclinD1、Bcl-xl蛋白表达，差异显著（P<0.05），且随着STA-21浓度增加上述蛋白表达量减少；对照组细胞P-STAT3、CyclinD1、Bcl-xl蛋白表达量与空白组接近（P>0.05）；5组细胞STAT3蛋白表达量近似（P>0.05）。第二部分：空白组MSCs表达STAT3，低表达MDM2、CyclinD1、Bcl-xl,不表达P-STAT3；对照组MSCs高表达MDM2、 P-STAT3、CyclinD1及Bcl-xl蛋白，各蛋白表达量显著高于空白组（P<0.05）；实验组MSCs经10、20、30μM STA-21处理后，与对照组相比，可明显降低MDM2、CyclinD1、Bcl-xl蛋白表达，且随着STA-21浓度增加上述蛋白表达量减少，其中均以20μm STA-21处理后变化显著，除10μm STA-21组少量表达P-STAT3外，其余实验组不表达P-STAT3，类似于空白组（P>0.05）；5组细胞STAT3蛋白表达量接近（P>0.05）。结论MSCs在体外模拟肿瘤微环境中的瘤样转化与STAT3蛋白持续性活化相关，利用STAT3特异性抑制剂STA-21可在一定程度上干预MSCs的瘤样转化，这为MSCs临床安全应用提供一定的实验基础。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-6
摘要  6-10
ABSTRACT  10-15
前言  15-17
第一部分 STAT3特异性抑制剂STA-21对乳腺癌MCF-7B细胞增殖及凋亡的影响  17-29
  1 材料和方法  17-22
  2 结果  22-25
  3 讨论  25-27
  参考文献  27-29
第二部分 STA-21 对规避异常微环境中骨髓间充质干细胞瘤样转化的影响  29-42
  1 材料和方法  29-36
  2 结果  36-39
  3 讨论  39-41
  参考文献  41-42
全文总结  42-43
文献综述  43-51
  参考文献  48-51
致谢  51-52
攻读学位期间发表的学术论文目录  52-53

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