学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

携带ING4和GMCSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究

作　者: 卓玲燕
导　师: 王毅刚
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: ING4 双基因 牛痘病毒 基因治疗 GMCSF
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
下　载: 2次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


近年来，癌症已成为严重威胁人类的生命和健康的罪魁祸首之一。传统的治疗癌症的方法由于受到各种原因的限制，效果并不理想且副作用明显。随着科学界对癌症治疗的不断探索，肿瘤的生物学疗法显示出了光明的前景。“癌症的靶向基因-病毒治疗”策略结合了基因治疗和病毒治疗的双重优势，对病毒载体的选择和抑癌基因的治疗效果提出了新的要求。痘苗病毒由于其安全性高,复制快等优点，可以作为理想基因治疗载体。而ING4基因广泛参与肿瘤发生和发展的多个过程，包括增强P53基因的活性，抑制HIF的活性而抑制肿瘤细胞生长。GMCSF即粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，是抗肿瘤免疫治疗中重要的细胞因子之一，能通过激活机体主动免疫来增强抗肿瘤的效果。结合病毒治疗和基因治疗的双重优点以及最近研究进展，本研究构思可以痘苗病毒为载体，以双基因为治疗基因构建出安全性好且杀伤效果更为显著的溶瘤痘苗病毒。其主要方法是将ING4-F2A-GMCSF双基因插入到pCB质粒载体TK区。痘苗病毒和质粒通过在细胞内发生同源重组将目的基因插入野生型痘苗病毒基因组中而得到携带目的基因的重组溶瘤痘病毒OncoPox-ING4-F2A-GMCSF。由于重组的发生的随机性，实验进展的瓶颈期是从混有野毒的病毒中得到重组目的病毒株，经过不断的药物筛选，现已成功构建出携带单基因的溶瘤痘苗病毒,分别是OncoPox-ING4和OncoPox-GMCSF，通过联合或单独作用初步探讨它们在体外实验中对癌细胞的杀伤效果。本研究经Western blot检测目的基因的蛋白表达来鉴定病毒，通过细胞感染病毒后形态学观察，MTT、Hoechst33342染色对细胞的存活率进行初步检测，流式细胞术进行定量的凋亡检测，最后通过TUNEL免疫荧光检测病毒是否引起染色体断裂而走向凋亡，结果显示OncoPox-ING4诱导凋亡的效果最显著，其余两组病毒处理呈现的杀伤效果较弱但均对正常细胞的显示了很好的安全性。由此，可初步得出OncoPox-ING4可在癌细胞内有效地发挥作用并引起凋亡。鉴于两个基因的作用机制，我们猜想OncoPox-GMCSF需要在机体内激活免疫系统才能发挥抗肿瘤作用，这为后期重组痘苗病毒的选择以及对后期在体内进一步研究奠定了一定的基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
缩写词表  7-8
目录  8-10
第一章 前言  10-18
  1.1 癌症治疗的现状  10-12
    1.1.1 癌症的基因治疗  11
    1.1.2 癌症的病毒治疗  11-12
  1.2 目的病毒构建的相关介绍  12-17
    1.2.1 痘苗病毒的生物学特点  12-13
    1.2.2 建重组痘苗病毒  13
    1.2.3 ING4 基因  13-15
    1.2.4 GM-CSF 基因  15-16
    1.2.5 口蹄疫病毒（foot and mouth virus disease, FMDV）2A  16-17
  1.3 实验目的和意义  17-18
第二章 重组痘苗病毒 Onco~(Pox)-ING4，Onco~(Pox)-GMCSF 的构建  18-41
  2.1 实验材料  18-22
    2.1.1 主要工具酶和生化试剂  18
    2.1.2 质粒与菌株  18
    2.1.3 主要溶液  18-19
    2.1.4 细胞株  19-20
    2.1.5 主要的实验仪器  20-21
    2.1.6 引物  21-22
  2.2 实验方法  22-30
    2.2.1 分子克隆  22-23
    2.2.2 重组质粒 pCB-ING4 的构建  23-26
    2.2.3 双基因质粒 pCB-ING4-F2A-GMCSF 的构建  26-30
  2.3 细胞实验部分  30-31
    2.3.1 细胞复苏  30
    2.3.2 细胞传代  30
    2.3.3 细胞冻存  30-31
  2.4 病毒构建部分  31-36
    2.4.1 病毒与质粒的共转染  31
    2.4.2 重组病毒株的药物筛选  31-32
    2.4.3 重组溶瘤痘苗病毒的单克隆病毒株的挑取  32
    2.4.4 病毒基因组的抽提  32-33
    2.4.5 痘苗病毒的 PCR 鉴定  33
    2.4.6 痘苗病毒滴度的测定  33-34
    2.4.7 Western blot 检测溶瘤重组痘苗病毒株蛋白表达  34-36
  2.5 实验结果  36-41
    2.5.1 重组质粒 pCB-ING4 构建的相关结果  36-37
    2.5.2 重组质粒 pCB-ING4-F2A-GMCSF 的构建的相关结果  37-39
    2.5.3 Western Blot 检测溶瘤痘苗病毒 Onco~(Pox)-ING4 和 Onco~(Pox)-GMCSF 的蛋白表达  39-41
第三章 重组痘苗病毒 Onco~(Pox)-ING4、Onco~(Pox)-GMCSF 联合对体外对肿瘤细胞的杀伤效应  41-54
  3.1 相关实验方法  41-43
    3.1.1 MTT 法检测细胞毒性  41
    3.1.2 凋亡细胞染色实验：Hoechst 33342 染色  41
    3.1.3 Annexin V/PI 双染色法检测细胞凋亡  41
    3.1.4 TUNEL 法检测细胞凋亡  41-43
  3.2 统计学分析  43
  3.3 实验结果  43-51
    3.3.1 细胞形态学观察  43-45
    3.3.2 MTT 法检测目的病毒的肺癌杀伤能力与安全性评价  45-46
    3.3.3 Hoechst 33342 染色观察细胞凋亡现象  46-47
    3.3.4 流式细胞术检测溶瘤痘苗病毒检测细胞凋亡现象  47-49
    3.3.5 TUNEL 检测细胞凋亡  49-51
  3.4 讨论  51-53
  3.5 展望  53-54
参考文献  54-58
致谢  58

相似论文

  1. 聚乙烯亚胺修饰糖脂共聚物介导基因治疗研究,R450
  2. 新型非病毒基因转染体系的构建及其在骨髓间充质干细胞基因重组中的应用,R346
  3. pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70真核表达载体的构建及对7402肝癌细胞生长的影响,R346
  4. 结合使用“鸡尾酒”疗法在提升自体脂肪移植于颜面整型手术的效果研究,R622
  5. 多灶性甲状腺乳头状癌的临床分析,R736.1
  6. Ad-PTEN对胃癌的抑瘤效应和化疗增敏效应及分子机制的研究,R735.2
  7. 脂质体介导的VEGF-C siRNA治疗肺癌体外实验研究,R734.2
  8. Ad-ING4-IL-24双基因共表达对肺癌的抑癌增效和化疗增敏的体外实验研究,R734.2
  9. p16精氨酸甲基化修饰及其功能的初步研究,R730.2
  10. 临床级全长抗体基因治疗平台的建立,R450
  11. 表达全长抗体Avastin的基因治疗系统联合CIK细胞治疗的实验研究,R450
  12. 利用杆状病毒系统规模化生产rAAV1的研究,R45
  13. 重症病毒性肝炎凋亡相关分子Fas，TNFR1miRNA腺病毒载体的构建及其体外干预研究,R512.6
  14. 选择复制性腺病毒M4对卵巢癌细胞系体外治疗作用及机制的初步探讨,R737.31
  15. 10KHZ电阻焊机用FRD二极管的研发与控制,TG43
  16. 对双基地雷达的干扰方法研究,TN974
  17. mPEG-CS纳米粒介导的livin和survivin双基因干扰对大肠癌细胞杀伤效率的研究,R735.34
  18. mPEG-CS介导的livin和survivin双基因干扰治疗大肠癌动物实验研究,R735.34
  19. hTERT启动子的克隆及其启动效率的研究,R730.2
  20. 胰高血糖素样肽-1及其类似物基因治疗糖尿病的研究,R587.1
  21. 筛选应用于β-地中海贫血基因治疗中的高效转导杂合型AAV载体,R556.61

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤治疗学
© 2012 www.xueweilunwen.com