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碳酸钙微球作为p53基因载体的研究

作　者: 韩华锋
导　师: 孔祥东
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 基因治疗碳酸钙微球表面修饰 p53基因抑癌效果
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

肿瘤发生多数与基因突变有关，因此，通过基因治疗手段改造或纠正突变基因对于癌症治疗具有重要意义。基因载体的安全性和有效性是实现基因治疗的关键因素之一。研究高效、安全的基因载体是当前研究的焦点。本论文采用化学沉淀法制备出三种不同性质的碳酸钙微球，并将碳酸钙（CaCO3）微球作为基因载体，用聚乙烯亚胺（PEI）表面修饰，探究经PEI修饰的碳酸钙微球作为基因传递载体的可能性及其携载重组质粒pEGFP-C1-p53的体内外抑癌效果。方法：（1）制备三种不同性质的球形CaCO3颗粒，通过场发射扫描电镜（SE-FEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶红外光谱（FTIR）以及动态光散射（DLS）等方法对合成的CaCO3颗粒形貌、粒径和结晶度等性质进行表征，建立稳定合成碳酸钙微球的工艺路线。（2）采用聚乙烯亚胺PEI对纳米结构的CaCO3微球表面修饰。研究表面修饰后的碳酸钙微球携载p53基因转染多种癌细胞和正常细胞（Hep3B、H1299、Hela、QSG-7701和293a）的效果。通过荧光显微镜观察GFP-P53融合蛋白的表达。（3）通过MTT实验研究碳酸钙微球的生物安全性及CaCO3-PEI-pDNA复合物的抑癌效果；Hoechst33342染色研究复合物的抑癌机理。（4）构建裸鼠Hep3B肝癌移植瘤模型，瘤内注射碳酸钙载体-基因复合物，探究修饰后的碳酸钙微球的体内抑癌效果，并通过肿瘤组织切片HE染色和TUNEL染色等病理学结果分析抑癌机制。结果：（1）通过添加不同的调控剂，制备出三种不同形貌、晶型及粒径大小的CaCO3微球，平均粒径分别为：960nm、976nm和510nm。三种颗粒形貌均为球形，分散性良好，粒径分布较均一且表面粗糙度较大。（2）通过研究在不同pH值条件下碳酸钙微球的降解情况，实验结果显示碳酸钙微球在酸性pH下能够更快速地降解，且与其它两种微球颗粒相比，SCa微球的酸性pH依赖性更大。说明碳酸钙微球能够响应酸性pH值，具有pH依赖性。通过研究不同浓度下碳酸钙微球的生物相容性情况，结果发现在一定浓度范围内三种碳酸钙微球的毒性较低，表明这三种碳酸钙微球都具有良好的生物相容性，且ACa的生物相容特性最佳。（3）体外细胞实验证实经表面修饰的CaCO3微球作为基因载体携载p53基因能够将基因传递至细胞内并成功表达融合蛋白GFP-P53，有效地抑制癌细胞增殖。（4）体内动物实验结果显示SCa-PEI-pEGFP-C1-p53能有效地抑制肿瘤生长。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章绪论  12-25
  1.1 引言  12
  1.2 基因治疗载体的研究现状  12-15
    1.2.1 病毒载体系统  13-14
    1.2.2 非病毒载体系统  14-15
  1.3 碳酸钙的基本性质  15-16
  1.4 纳米碳酸钙的国内外研究现状  16-22
    1.4.1 纳米碳酸钙制备方法的研究现状  16-18
    1.4.2 碳酸钙颗粒表面修饰的研究现状  18-19
    1.4.3 纳米碳酸钙在生物医学领域中的研究现状  19-21
      1.4.3.1 纳米碳酸钙用于药物传递载体的研究进展  19-21
      1.4.3.2 纳米碳酸钙用于基因转染载体的研究进展  21
    1.4.4 纳米碳酸钙载体在医学领域的应用展望  21-22
  1.5 p53 抑癌基因  22-23
  1.6 本论文的研究目的和意义  23
  1.7 本论文研究内容  23-25
第二章碳酸钙颗粒的制备、改性及性能表征  25-37
  2.1 引言  25
  2.2 实验部分  25-31
    2.2.1 实验试剂与仪器  25-27
      2.2.1.1 实验仪器  25-26
      2.2.1.2 实验试剂  26
      2.2.1.3 主要试剂溶液的配制  26-27
    2.2.2 三种碳酸钙微球的制备方法及其改性修饰  27-30
      2.2.2.1 三种 CaCO3微球的制备  27-30
      2.2.2.2 三种碳酸钙微球的表面修饰  30
    2.2.3 碳酸钙颗粒的材料表征方法  30-31
    2.2.4 碳酸钙颗粒不同 pH 值下降解实验  31
  2.3 结果与分析  31-35
    2.3.1 碳酸钙微球的表征结果  31-34
    2.3.2 碳酸钙微球在不同 pH 值下的降解实验  34-35
  2.4 本章小结  35-37
第三章载体与重组质粒基因复合  37-43
  3.1 引言  37
  3.2 实验部分  37-41
    3.2.1 实验材料与仪器  37-38
      3.2.1.1 实验材料  37
      3.2.1.2 实验仪器  37-38
      3.2.1.3 主要试剂配方  38
    3.2.2 载体-重组质粒基因复合  38-41
      3.2.2.1 质粒 pEGFP-C1-p53 的转化、小量制备和鉴定  38-40
        3.2.2.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  38-39
        3.2.2.1.2 质粒 pEGFP-C1-p53 的转化  39
        3.2.2.1.3 质粒小量制备  39-40
        3.2.2.1.4 重组质粒 pEGFP-C1-p53 的鉴定  40
      3.2.2.2 质粒 pEGFP-C1-p53 和 pEGFP-C1 的大量抽提  40-41
  3.3 结果与分析  41-42
  3.4 本章小结  42-43
第四章体外细胞实验和体内动物实验  43-57
  4.1 引言  43
  4.2 实验部分  43-45
    4.2.1 实验材料与设备  43-45
      4.2.1.1 实验仪器  43-44
      4.2.1.2 实验材料  44
      4.2.1.3 主要试剂配方  44-45
  4.3 实验方法  45-50
    4.3.1 细胞培养技术及体外转染实验  45-47
    4.3.2 碳酸钙颗粒的生物相容性实验  47
    4.3.3 CaCO3-PEI-pEGFP-C1 转染细胞荧光观察  47-48
    4.3.4 碳酸钙颗粒体外杀伤效果的检测  48
      4.3.4.1 凋亡细胞染色实验：Hoechst 33342 染色  48
      4.3.4.2 MTT 细胞毒性实验  48
    4.3.5 动物实验方法  48-50
      4.3.5.1 裸鼠 Hep3B 肝癌皮下移植瘤模型的建立及分组治疗  48-49
      4.3.5.2 HE 染色  49
      4.3.5.3 TUNEL 法检测细胞凋亡  49-50
  4.4 结果与统计分析  50-56
    4.4.1 碳酸钙颗粒的生物相容性实验  50
    4.4.2 体外转染的荧光观察  50-51
    4.4.3 碳酸钙颗粒体外杀伤效果的检测  51-54
      4.4.3.1 凋亡细胞染色实验：Hoechst 33342 染色  52
      4.4.3.2 MTT 细胞毒性实验  52-54
    4.4.4 SCa-PEI-pEGFP-C1-p53 对移植瘤的生长抑制作用研究  54
    4.4.5 SCa-PEI-pEGFP-C1-p53 抑癌效果的病理分析  54-56
      4.4.5.1 HE 染色  54-55
      4.4.5.2 TUNEL 分析  55-56
  4.5 本章小结  56-57
第五章结论  57-58
参考文献  58-64
致谢  64-65
硕士期间研究成果  65

碳酸钙微球作为p53基因载体的研究

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