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重组人隐花色素蛋白Ⅰ的表达纯化及其在制备放疗保护剂中的应用

作　者: 姚辰
导　师: 黄文林
学　校: 安徽大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人隐花色素蛋白I 蛋白表达纯化放疗保护剂
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

在癌症的临床治疗方法中,放疗的适应症最为广泛,70%以上的恶性肿瘤患者在其治疗的某个阶段都需要接受放疗。放射治疗的目的是最大限度地将放射剂量集中到病变区,而周围正常组织或器官则需要尽量少受不必要的照射。因此,寻找一些尽可能地保护正常皮肤、组织、器官的方法就成为了放疗过程中减轻患者痛苦、提高治疗效果的关键所在。在本研究中,我们通过原核表达质粒的构建,利用E. coli BL21(DE3)诱导并成功表达出人隐花色素蛋白I(hCRY1)。我们在多次实验探索的过程中筛选获得了能够高效表达hCRY1的菌株。我们对温度、转速、IPTG浓度、诱导时间等多项影响重组蛋白表达的因素进行了摸索,最终总结出最适宜hCRY1蛋白诱导表达的实验条件。我们在研究中采用包涵体溶解、梯度透析复性、镍柱亲和纯化以及超滤置换的蛋白纯化工艺,1L菌液可收获10-15mg纯度超过95%的hCRY1,该产率远高于目前所已知的其他方法,而由于该原核表达纯化方法所需要的培养基及后续纯化原料相对廉价,成本经计算远低于真核表达纯化方法和化学合成多肽方法。此外,我们还分别在Hela细胞中,通过细胞DNA损伤修复中所产生的H2A.X foci荧光强度的定量检测,验证了纯化所得的hCRY1具有射线损伤防护功能；在HaCaT细胞中验证了hCRY1射线损伤防护效果与其浓度的相关性。为了排除了hCRY1的毒副作用对H2A.X foci荧光强度的影响,我们以TNF-α为阳性对照,对经过hCRY1以及对照蛋白处理后的细胞凋亡情况进行了检测,结果证明了foci荧光强度的降低是由于细胞内DNA所受损伤的减少而非蛋白对细胞的毒性作用。我们的工作为进一步研究hCRY1提供了便利条件,也为将hCRY1开发成为新的放疗保护剂提供了理论基础。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-8
第一部分文献综述  8-23
  1.癌症与放疗  8-11
  2.隐花色素的功能研究进展  11-13
  3.蛋白原核表达纯化技术简介  13-15
  4.利用胞内H2A.X foci检测蛋白射线防护功能的理论基础  15-17
  5.结论  17
  参考文献  17-23
第二部分实验部分  23-49
  第一章 hCRY1的诱导表达  23-35
    1.引言  23-24
    2.材料和方法  24-27
    3.结果  27-33
    4.讨论  33-34
    参考文献  34-35
  第二章 hCRY1的分离纯化  35-41
    1.引言  35
    2.材料和方法  35-38
    3.结果  38-39
    4.讨论  39-40
    参考文献  40-41
  第三章 hCRY1作为放疗保护剂的应用初探  41-49
    1.引言  41-42
    2.材料与方法  42-44
    3.结果  44-47
    4.讨论  47
    参考文献  47-49
全文小结  49-50
攻读硕士期间研究成果  50-51
致谢  51-52

重组人隐花色素蛋白Ⅰ的表达纯化及其在制备放疗保护剂中的应用

内容摘要

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