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核酸适配体用于实体瘤活体荧光成像研究

作　者: 崔文思
导　师: 何晓晓
学　校: 湖南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Aptamer 实体瘤酸性激活活体荧光成像 cell-SELEX
分类号: R730.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

实体瘤在具有高发病率和高致死率的恶性肿瘤中占绝大多数比例,严重危害人类健康和生命。探索实体瘤的早期诊断和准确分型新方法和新技术现已成为肿瘤医学研究领域亟待解决的焦点问题之一。近年来,利用特异性分子探针进行活体、实时、原位成像研究的分子影像学技术的出现,为实现肿瘤发生发展过程中分子水平生物学行为的定性和定量分析提供了契机,从而有望使肿瘤检测水平提前至分子异常阶段,满足早期诊断和分型需求。核酸适配体(aptamer)作为一类极具应用前景的新兴肿瘤靶向识别分子,由于具备亲和力高、特异性好、合成简单且重复性好、修饰灵活、免疫原性低等一系列优点,为发展新型肿瘤活体成像技术提供了一类理想的分子探针。基于此,本论文即瞄准这一前沿研究方向,以肺癌、肝癌等实体瘤为研究对象,选取基于cell-SELEX技术筛选的aptamer探针作为靶向识别分子,构建了一系列肿瘤成像探针,并结合活体荧光影像技术,系统开展了小鼠体内实体瘤的实时、原位荧光成像研究。主要包括以下两个方面的工作：1、Cy5染料标记的"always on" aptamer用于多种实体瘤活体荧光成像研究针对目前基于cell-SELEX技术筛选的aptamer探针在活体肿瘤成像应用中主要集中于B淋巴瘤细胞、人白血病细胞等血液瘤的研究现状,首先选择A549非小细胞肺癌为模型,采用文献报道的特异性aptamer S6为靶向识别分子,通过直接标记Cy5近红外荧光染料成功构建了可用于A549肿瘤活体检测的"always on"成像探针Cy5-S6。经流式细胞分析证实,无论是缓冲液中的体外培养A549细胞或小鼠血清中的原代培养A549细胞,Cy5-S6均显示出特异性检测性能。活体荧光成像结果也表明,Cy5-S6在小鼠体内不仅显示出对A549肿瘤的靶向成像能力,而且还具有优越的序列特异性和肿瘤选择性。在此基础上,为进一步拓展基于cell-SELEX技术筛选的aptamer探针对其他类型肿瘤的活体成像应用,又分别选取了Bel-7404和SMMC-7721肝癌作为考察对象,利用本实验室自行筛选的特异性aptamer成功构建了可用于Bel-7404肿瘤成像的Cy5-LS2探针和可用于SMMC-7721肿瘤成像的Cy5-ZY8探针。通过一系列体内外系统考察发现,上述探针不仅可实现靶肿瘤细胞的体内外特异性检测与成像,甚至在同一只小鼠体内也可有效达到区分不同类型肝癌细胞的目的。这一研究不仅将基于cell-SELEX技术筛选的aptamer作为新型肿瘤活体成像探针成功拓展到实体瘤研究领域,还进一步为cell-SELEX技术在筛选特异性分子成像探针方面的应用提供了有力支持。2、酸性激活式aptamer探针用于A549非小细胞肺癌活体荧光成像研究针对上述"always on"模式探针在肿瘤活体荧光成像应用中仍然存在的背景信号较高、成像对比度有限、检测时间较长等不足,选择肿瘤部位的酸性微环境以及肿瘤细胞内的溶酶体酸性环境为靶刺激,以A549非小细胞肺癌为模型,利用酸敏小分子3,9-双(3-氨丙基)-2,4,8,10-四氧杂螺十一烷(ATU)将Cy5标记的特异性aptamer S6与荧光淬灭分子BHQ3连接,成功构建了一种同时具有靶肿瘤细胞识别性能和信号开关模式的酸性激活式aptamer探针(AAAP)。该探针在中性环境中荧光信号处于高效淬灭状态,而当置于pH4.5的缓冲液中24小时即可实现90%以上的荧光恢复。随后通过激光共聚焦显微成像考察发现,与阴性对照探针和阴性肿瘤细胞相比,AAAP可在A549肿瘤细胞内有效产生特异性荧光激活成像效果。活体荧光成像结果也表明,与"always on"探针相比,AAAP在直接注射入A549肿瘤后,具有显著降低荧光背景的优势,并展示出荧光信号由弱变强的激活式成像性能。然而,进一步以尾静脉注射方式对AAAP的活体肿瘤激活式成像性能考察结果却显示,AAAP虽然能够实现裸鼠体内A549肿瘤的特异性成像,但由于代谢速度过快导致肿瘤部位探针浓度有限,其肿瘤活体成像对比度仍有待提高。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
缩略词表  10-13
第1章绪论  13-29
  1.1 实体瘤诊断的重要性及常规方法  13-18
    1.1.1 恶性实体瘤的危害  13-14
    1.1.2 实体瘤的常见诊断方法  14-18
  1.2 Aptamer在肿瘤诊断中的应用  18-27
    1.2.1 Aptamer的筛选  18-19
    1.2.2 Aptamer的特点  19-20
    1.2.3 Aptamer在肿瘤细胞检测和成像中的应用  20-23
    1.2.4 Aptamer在肿瘤活体成像中的应用  23-27
  1.3 本文构思  27-29
第2章 Cy5染料标记的“always on”aptamer用于多种实体瘤活体荧光成像研究  29-44
  2.1 前言  29-30
  2.2 实验部分  30-34
    2.2.1 试剂和仪器  30-32
    2.2.2 肿瘤细胞的培养与传代  32
    2.2.3 原代培养A549、Bel-7404和SMMC-7721细胞株的建立  32
    2.2.4 流式细胞检测  32-33
    2.2.5 肿瘤活体荧光成像  33
    2.2.6 离体器官解剖和定点揭开肿瘤部位皮肤成像  33
    2.2.7 肿瘤组织切片的HE染色  33
    2.2.8 肿瘤组织切片的荧光成像考察  33-34
  2.3 结果与讨论  34-43
    2.3.1 Cy5染料标记的“always on”aptamer用于肺癌活体荧光成像研究  34-37
    2.3.2 Cy5染料标记的“always on”aptamer探针用于肝癌活体荧光成像研究  37-43
  2.4 小结  43-44
第3章酸性激活式aptamer探针用于A549非小细胞肺癌活体荧光成像研究  44-53
  3.1 前言  44-45
  3.2 实验部分  45-47
    3.2.1 试剂和仪器  45-46
    3.2.2 肿瘤细胞的培养与传代  46
    3.2.3 紫外-可见吸收光谱表征  46
    3.2.4 缓冲液中的酸性激活性能表征  46
    3.2.5 激光共聚焦显微成像  46
    3.2.6 活体荧光成像  46-47
  3.3 结果与讨论  47-52
    3.3.1 实验原理  47
    3.3.2 AAAP吸收光谱表征  47
    3.3.3 AAAP在酸性缓冲液中的激活特性表征  47-48
    3.3.4 AAAP对A549肿瘤细胞的特异性成像  48-49
    3.3.5 AAAP用于A549肿瘤的激活式活体荧光成像  49-52
  3.4 小结  52-53
结论  53-54
参考文献  54-63
致谢  63-64
附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录  64

核酸适配体用于实体瘤活体荧光成像研究

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