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骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠酒精性痴呆及机制

作　者: 曾玉娥
导　师: 吴晓牧
学　校:
专　业: 神经病学
关键词: 骨髓间充质干细胞酒精性痴呆移植大鼠机制
分类号: R749.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：1.探索建立酒精性痴呆模型的最佳条件。2.探讨骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)移植治疗大鼠酒精性痴呆（alcohol-associated dementia，AAD）的疗效及其机制。方法：1、以SD大鼠为研究对象，按数字随机方法分为：①20%酒精(4ml/kg/d)灌胃28d组；②20%酒精(4ml/kg/d)腹腔注射28d组；③20%酒精(4ml/kg/d)灌胃14d组；④20%酒精(8ml/kg/d)灌胃14d组；⑤20%酒精(12ml/kg/d)灌胃14d组；⑥生理盐水(4ml/kg/d)灌胃28d对照组；⑦生理盐水(4ml/kg/d)腹腔注射28d对照组；⑧生理盐水（4ml/kg/d）灌胃14d。探索建立AAD大鼠模型最佳条件。2、Morris水迷宫行为学检测逃避潜伏期（Escape Latency，EL），以测定大鼠痴呆程度。3、HE组织化学染色检测酒精性痴呆大鼠海马齿状回脑组织损伤形态学变化。4、Hoechst荧光染色观察、计数酒精性痴呆大鼠海马齿状回凋亡神经细胞。5、直接贴壁法分离、培养、纯化和扩增BMMSCs。6、流式细胞仪鉴定BMMSCs表面抗原CD90、CD29、CD34、CD45。7、选择最适合的AAD大鼠模型建立方法[(20%酒精(4ml/kg·d)灌胃28d]，同时设立生理盐水对照组评估模型。AAD模型建立1周后采用静脉或立体定向移植途径移植3×106BMMSCs或PBS，Morris水迷宫行为学检测BMMSCs移植后EL改变。8、各组大鼠脑组织HE、Hoechst33342染色观察、计数BMMSCs静脉移植或立体定向移植后脑组织海马齿状回形态和凋亡神经细胞数的变化。9、免疫组织化学检测大鼠海马齿状回、CA1区、CA3各区BDNF的表达。10、采用比色法检测大鼠血清T-SOD和GSH-PX活力。结果：1、与相应生理盐水对照组相比，20%酒精(4ml/kg·d)灌胃14d或28d组均可诱导大鼠学习记忆功能明显损害，大鼠EL均显著延长（P<0.05）；而20%酒精(4ml/kg·d)腹腔注射28d、20%酒精(8ml/kg·d，中剂量)灌胃14d、20%酒精(12ml/kg·d，高剂量)灌胃14d等3组大鼠EL延长与20%酒精(4ml/kg·d)灌胃28d组无显著统计学差异（P>0.05）。2、HE染色显示各AAD模型组大鼠海马齿状回出现散在或局灶分布的异形神经细胞。3、Hoechst33342荧光染色显示各AAD模型组大鼠海马齿状回的异形细胞呈局灶碎片、浓染的凋亡形态，与相应对照组相比其凋亡细胞增多，与对照组相比酒精灌胃14d和28d增多均有显著性差异（P<0.05），且随着酒精灌胃时间延长，海马齿状回凋亡神经细胞数显著增多（F=20.74，P<0.001）。然而酒精对神经细胞凋亡的影响并不随酒精剂量的增加而增加（P>0.05）。4、BMMSCs贴壁生长，形态呈梭形，流式细胞仪鉴定高表达CD29(98.6%)和CD90(80.4%)，低表达CD34（0.1%）和CD45(5.8%)。5、与生理盐水对照组相比，选择20%酒精(4ml/kg·d)灌胃28d成功建立AAD模型，AAD模型组大鼠EL显著延长（P<0.05）。AAD模型大鼠BMMSCs静脉或立体定向移植2周后与PBS移植组比较，大鼠空间定向学习记忆功能显著改善，MWM行为学检测EL均显著缩短。6、BMMSCs尾静脉移植和立体定向移植2周后与PBS移植组相比，AAD大鼠海马齿状回异性病理形态的神经细胞少且散在，凋亡的神经细胞数显著减少（P<0.05）；7、与生理盐水对照组比较，AAD模型组海马DG、CA1和CA3区BDNF表达均降低，而与PBS静脉或立体定向移植2周后AAD组比较，BMMSCs静脉或立体定向移植2周后大鼠海马DG、CA1、CA3区BDNF表达均增高，且静脉移植组CA1区BDNF表达增高有显著性意义（P<0.05），定向移植组DG和CA1区BDNF表达增高有显著性意义（P<0.05）；8、与生理盐水对照组比较，AAD模型组大鼠血清T-SOD和GSH-PX酶活力均降低，而BMMSCs尾静脉移植或立体定向移植2周后AAD大鼠血清T-SOD和GSH-PX酶活力均增加，且静脉移植组GSH-PX活力增加有显著性差异（P<0.05），立体定向移植组大鼠血清T-SOD活力增加有显著性差异（P<0.05）。结论：1、低剂量（20%酒精4ml/kg）酒精灌胃14-28d是AAD动物模型建立的最适宜条件。2、BMMSCs立体定向或静脉移植均可通过增加海马BDNF表达及提高T-SOD和GSH-PX活力等抗氧化应激反应能力等抑制AAD大鼠海马神经细胞凋亡、改善AAD大鼠视空间定向学习记忆能力。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-11
中英文缩略词表  11-12
第1章引言  12-14
第2章材料与方法  14-27
  2.1 材料与仪器  14-15
    2.1.1 主要实验试剂  14-15
    2.1.2 主要仪器  15
  2.2 方法  15-27
    2.2.1 探索 AAD 大鼠模型建立最佳条件的实验分组及模型建立  15-16
    2.2.2 一般情况观察  16-17
    2.2.3 Morris 水迷宫（Morris Water Maze，MWM）行为学检测  17-18
    2.2.4 4%多聚甲醛灌注  18
    2.2.5 脑组织 HE 染色  18-19
    2.2.6 脑组织 Hoechst33342 染色  19
    2.2.7 AAD 模型大鼠 BMMNCs 移植分组  19-20
    2.2.8 全骨髓贴壁法分离和扩增 BMMSCs  20
    2.2.9 BMMSCs 的鉴定  20-21
    2.2.10 立体定向途径移植 BMMSCs 治疗 AAD 模型大鼠  21
    2.2.11 尾静脉途径移植 BMMSCs 治疗 AAD 模型大鼠  21
    2.2.12 Morris 水迷宫（Morris Water Maze，MWM）行为学检测  21
    2.2.13 脑组织切片免疫组织化学染色（二步法）  21-22
    2.2.14 图片采集与测量  22
    2.2.15 总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力测定  22-24
    2.2.16 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力检测  24-26
    2.2.17 统计学分析  26-27
第3章结果  27-37
  3.1 一般情况  27
  3.2 建模条件探索  27-29
    3.2.1 酒精作用时间和途径与 AAD 模型关系  27-28
    3.2.2 酒精剂量与 AAD 模型关系  28-29
  3.3 各组大鼠海马组织 HE 染色  29
  3.4 AAD 模型各组大鼠海马组织细胞凋亡  29-31
  3.5 BMMSCs 体外培养的形态  31
  3.6 BMMSCs 鉴定  31-32
  3.7 BMMSCs 移植后 Morris 水迷宫行为学检测  32-33
  3.8 BMMSCs 移植后各组大鼠海马组织 HE 染色  33
  3.9 BMMSCs 移植后各组大鼠海马齿状回神经细胞 Hoechst33342 染色细胞凋亡  33-34
  3.10 BMMSCs 移植后各组大鼠海马区 BDNF 表达变化  34-36
  3.11 BMMSCs 移植后各组大鼠血清氧化应激改变  36-37
第4章讨论  37-41
第5章结论  41-42
致谢  42-43
参考文献  43-46
攻读学位期间研究成果  46-47
附图  47-54
综述  54-60
  参考文献  58-60

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠酒精性痴呆及机制

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