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白藜芦醇对SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层LC3B的影响

作　者: 李园园
导　师: 宋学琴
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: SOD1-G93A转基因小鼠白藜芦醇酒精自噬微管相关蛋白1轻链3
分类号: R744
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种进行性致死性神经退行性疾病,以上下运动神经元受损为特征。临床表现为肌无力，肌萎缩，呼吸肌麻痹，平均生存期为3-5年。ALS中运动神经元的损伤和凋亡机制复杂，有多种机制参与，包括错误折叠蛋白聚集、氧化应激、钙离子超载、谷氨酸兴奋毒性、营养因子缺乏、线粒体功能障碍等。这些病理机制可能相互作用，促进了疾病的发生发展。前期试验中我们发现，ALS中线粒体的分裂和融合及其线粒体自噬存在障碍。自噬（autophagy）是真核细胞的一种保护机制,可以通过自噬清除细胞内的许多有害物质。自噬能够隔离包裹分解陈旧、过剩、损伤或者异常的细胞器和其它胞浆成分，为细胞的正常生存、更新提供稳定的环境，保障细胞高效率的新陈代谢，从而实现机体的平衡稳定。自噬包括巨自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬三种方式。目前许多研究关注巨自噬，巨自噬也是我们此次研究的方向。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein1light chain3, LC3）是酵母菌自噬相关基因Atg8在哺乳动物的同源体。LC3有三种亚蛋白LC3A、LC3B、LC3C。LC3I和LC3II是LC3在细胞内的两种存在形式。LC3I位于胞浆中是可溶性物质，LC3II位于胞膜上与磷脂结合。LC3II是自噬泡的组成成分，是自噬的标记物。自噬增强时，LC3I向LC3II的转变增多。在许多神经退行性疾病中，胞浆、胞核或者细胞外基质聚集有破损的细胞器和异常蛋白质等成分，这些异常聚集的物质具有细胞毒性，能够诱导细胞凋亡。细胞可以通过自噬清除有害物质，自噬维持了细胞内环境的稳定。自噬也就成为治疗神经退行性疾病的靶点。白藜芦醇(resveratrol, res)是一种自然源性酚类物质。有报道，在阿尔兹海默病(Alzheimer’s diseases，AD)、帕金森病（Parkinson’s disease，PD)中，白藜芦醇可以激动Sirt1（silent mating type information regulation2homolog1）或者AMPK(AMP-activated protein kinase)，从而诱导自噬，提高LC3水平。自噬的增强可以更好的降解异常蛋白，保护神经元。AD、PD和ALS都是神经变性病，白藜芦醇在ALS中是不是也可以调节自噬，影响LC3水平，保护神经元呢？本实验我们试图观察，随着疾病的进展，LC3B在SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层中的动态变化，及其予以白藜芦醇后，SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层中LC3B的变化，进一步了解ALS的病理机制，探讨白藜芦醇通过影响自噬治疗ALS的可行性。方法：实验组实验对象选取SOD1-G93A转基因小鼠，依据病程分为症状前期组（60d组）、症状早期组（onset组）、终末期组（end组），对照组实验对象选取90天野生型小鼠，每组6只小鼠。从70天开始，予以SOD1-G93A小鼠三种不同处理方式，直至症状早期或者终末期取材。三种不同处理方式分别为：白藜芦醇组予以白藜芦醇溶剂（30mg/kg/d），溶剂组予以同等体积酒精溶剂，空白组未予处理。症状早期和终末期的不同处理组均有6只小鼠用于实验。腹腔注射10%水合氯醛(350mg/kg)，麻醉小鼠后，处死小鼠，取腰髓和运动皮层投入液氮冷冻，保存于-80℃冰箱；经心脏灌注4%多聚甲醛，剥离小鼠腰髓和运动皮层，用4%多聚甲醛浸泡保存。利用Western blot技术、免疫组织化学技术、激光共聚焦技术，观察LC3B在各时期及各种不同处理方式下小鼠腰髓和运动皮层中的变化。数据应用spss13.0统计软件进行分析。结果：1不同时期SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层LC3B的含量：应用Westernblot技术检测到，与对照组相比，症状早期和终末期SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层中LC3BII表达量增加，症状前期LC3BII表达量无明显变化。免疫组织化学显示，与对照组相比，症状早期和终末期SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层中运动神经元减少，LC3B表达量增加，症状前期LC3B表达量无明显差异。激光共聚焦技术检测LC3B与SMI32共定位情况，与对照组相比，症状早期和终末期SOD1-G93A小鼠腰髓运动神经元中LC3B表达量增加，症状前期LC3B表达量无明显差异。2白藜芦醇对SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层LC3B含量的影响：2.1症状早期：应用Western blot技术检测到，与空白组相比，在SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层中，白藜芦醇组LC3BII水平有升高趋势，溶剂组LC3BII水平显著升高。应用免疫组织化学技术检测到，白藜芦醇组和溶剂组SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层中LC3B表达增加。应用激光共聚焦技术检测LC3B与SMI32共定位情况，发现白藜芦醇组和溶剂组SOD1-G93A小鼠腰髓运动神经元中LC3B表达增加。2.2终末期：应用Western blot技术检测到，白藜芦醇组、溶剂组、空白组，三组间SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层LC3BII表达无差异。应用免疫组织化学技术检测到三组间SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层LC3B表达无差异。应用激光共聚焦技术检测到LC3B在三组间SOD1-G93A小鼠腰髓运动神经元表达无差异。结论：1随着疾病的进展，SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层中LC3B水平逐渐升高，表明自噬有增强的趋势。2白藜芦醇对SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层中LC3B的表达影响有限，白藜芦醇通过影响自噬发挥保护神经元的作用需要进一步研究。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
前言  11-12
材料与方法  12-17
结果  17-18
附图  18-25
讨论  25-29
结论  29
参考文献  29-33
综述白藜芦醇对自噬的影响  33-41
  参考文献  38-41
致谢  41-42
个人简历  42

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