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宫颈癌中Rap1GAP表达下调机制的研究

作　者: 孙悦
导　师: 赵春艳
学　校: 大连医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 宫颈癌 Rap1GAP HPV16E6 蛋白降解 泛素-蛋白酶体途径
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：探讨宫颈癌中Rap1GAP表达下调机制，为进一步揭示宫颈癌发生发展的分子生物学机制奠定理论基础。宫颈癌位于世界女性恶性肿瘤死亡顺位的第二位。据WHO报道，每年近有51万宫颈癌新发病例和28.8万死亡病例，其中发展中国家约占80%:非洲6.8万、拉丁美洲7.7万、亚洲24.5万。肿瘤的发生发展与多种因素有关，原癌基因的激活和抑癌基因的失活是其重要的分子生物学机制。流行病学研究证实宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒HPV的感染密切相关，其致癌机制主要通过高危型人乳头瘤病毒癌蛋白E6对癌基因或抑癌基因的激活、失活起作用，如E6通过泛素-蛋白酶体途径降解Rap1GAP同家族成员E6TP1（E6target protein1），这一机制与宫颈癌的发生发展密切相关。抑癌基因Rap1GAP（Rap1GTPase-activatingprotein）在多种肿瘤中表达下调，体外过表达Rap1GAP后肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移等生物学功能受到抑制，进而发挥其肿瘤抑制功能。本研究组前期实验显示，宫颈癌组织内Rap1GAP表达下调，并且Rap1GAP蛋白表达水平与HPV感染呈负相关。因此本文将探讨高危型人乳头瘤病毒癌蛋白E6对Rap1GAP蛋白降解的影响，以期阐明宫颈癌中Rap1GAP表达下调的分子生物学机制。方法：1.采用脂质体转染法将HPV16E6质粒转染入细胞中，荧光显微镜下及RT-PCR法检测外源基因转染效率2.采用Western blot方法观察HPV16E6对细胞中内源性Rap1GAP蛋白降解的影响3.采用MTT法观察不同浓度MG132对细胞增殖的抑制情况4.采用脂质体法将Rap1GAP及HPV16E6质粒共转染入细胞中，Western blot方法观察MG132对HPV16E6降解Rap1GAP的影响。结果：1.荧光显微镜观察显示，vector共转染组与E6共转染组转染效率约60%-70%。2.在Hela细胞中，过表达HPV16E6后，Rap1GAP蛋白的相对表达量（0.777±0.150）明显低于未转染组（1.150±0.092），差异具有显著性（p<0.05）；而在HEK293细胞中，过表达HPV16E6后，Rap1GAP蛋白的相对表达量（0.890±0.128）与未转染组（1.140±0.203）相比差异无显著性（p>0.05）。3.不同浓度MG132对细胞增殖影响的实验表明，与空白组和DMSO组相比，当MG132为1μM时，其对细胞增殖无明显抑制作用（p>0.05）；MG132为3μM时，第三天起对细胞增殖产生抑制作用（p<0.05）；MG132>5μM时,第二天起即对细胞增殖产生抑制作用（p<0.05）。4.将Rap1GAP及HPV16E6质粒共转染入细胞后，无MG132时，在Hela细胞中，外源性Rap1GAP蛋白的相对表达量（0.860±0.028）低于对照组（1.050±0.014），差异具有显著性（p<0.05）；加入MG132（1μM、3μM）后，外源性Rap1GAP蛋白的相对表达量分别为（1.085±0.064）和（1.045±0.050），与对照组（1.055±0.106）和（1.015±0.120）相比，差异均无显著性（p>0.05）；而在HEK293细胞中，无MG132时，E6共转染组外源性Rap1GAP蛋白的相对表达量（1.130±0.212）与对照组（1.085±0.148）相比差异无显著性（p>0.05）；加入MG132（1μM、3μM）后，E6共转染组外源性Rap1GAP蛋白的相对表达量分别为（1.155±0.050）和（1.125±0.107），与对照组（1.145±0.177）和（1.185±0.106）相比，差异均无显著性（p>0.05）。结论：1.过表达HPV16E6可下调Hela细胞中的Rap1GAP蛋白；而HEK293细胞中则无此作用。2.HPV16E6通过泛素-蛋白酶体途径下调Rap1GAP蛋白的表达。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-13
材料和方法  13-22
  1.材料  13-16
    1.1 细胞及细胞培养相关试剂  13
    1.2 细菌培养相关试剂  13
    1.3 质粒转化与提取相关试剂  13-14
    1.4 转染相关试剂  14
    1.5 western blot 相关试剂  14
    1.6 其它试剂  14-15
    1.7 实验试剂的配制  15-16
    1.8 主要仪器  16
  2.方法  16-22
    2.1 细胞培养  16
    2.2 质粒的转化及提取  16-17
    2.3 细胞总 RNA 提取  17-18
    2.4 琼脂糖凝胶电泳  18
    2.5 E6 的逆转录-聚合酶链式反应  18-19
    2.6 MG132 浓度对细胞增殖的影响  19
    2.7 脂质体转染及共转染  19-20
    2.8 Western blot  20-22
    2.9 统计学处理  22
结果  22-28
  1.HPV16 E6 降低内源性 Rap1GAP 的蛋白表达  22-24
    1.1 质粒制备  22-23
    1.2 HPV16 E6 对内源性 Rap1GAP 表达的影响  23-24
  2. HPV16 E6 通过泛素蛋白酶体通路降解 Rap1GAP  24-28
    2.1 细胞转染效率检测  24-26
    2.2 MG132 浓度的的确定  26-27
    2.3 HPV16 E6 通过泛素蛋白酶体途径降解外源性Rap1GAP蛋白  27-28
讨论  28-33
结论  33-34
参考文献  34-39
综述  39-49
  参考文献  45-49
致谢  49-50

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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