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新型人工颈椎间盘不同涂层体外生物相容性的实验研究

作　者: 李俊辉
导　师: 徐林
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 新型人工颈椎间盘假体涂层骨髓间充质干细胞体外实验细胞相容性血液相容性
分类号: R318.17
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

背景：目前脊柱外科临床上颈椎病的发病率呈上升趋势,且年轻患者所占比重逐渐增大,对于保守治疗效果不理想的患者需要进行手术治疗,传统的颈椎前路减压植骨融合术存在邻近关节退变加速、取骨处疼痛等并发症,而人工颈椎间盘置换术克服了上述不足,且保留了颈椎的生理活动度,近十年来得到了脊柱外科医师和研究者的认可并得到了较快的发展。我国目前脊柱外科临床上使用的人工颈椎间盘全部被欧美产品所垄断,欧美产品价格昂贵,存在一些不足。在这种形势下,清华大学深圳研究院联合我院及多家院校进行合作,致力于研发符合中国人颈椎生理特征的新型人工颈椎间盘,其上下终板材料为钛合金,钛合金具有良好的生物相容性,但钛合金存在生物活性差、与骨结合强度低、在生理环境下易造成金属离子释放等问题。目的：设计研发出符合中国人生理特征和尺寸的新型人工颈椎间盘,并对间盘上下终板进行不同涂层喷涂改性,观察3种不同涂层的体外细胞相容性和血液相容性,评价新型人工颈椎间盘3种不同涂层的体外生物相容性,为后期的实验研究及临床应用提供实验依据。方法：1、对新型人工颈椎间盘3种不同涂层进行场发射扫描电镜观察及X射线能谱仪检测；2、从Wistar大鼠股骨、胫骨骨髓分离BMSCs,贴壁培养法对其进行传代和纯化,按照1：3比例进行传代,以后4～5天传代1次,对第3代大鼠BMSCs进行鉴定,用符合鉴定标准的大鼠BMSCs进行国产人工颈椎间盘间盘不同涂层体外细胞相容性实验；3、将大鼠BMSCs与3组不同涂层样品共同培养,观察大鼠BMSCs在不同样品表面的黏附分化能力,检测ALP分泌活性及样品的细胞毒性,以评价国产人工颈椎间盘不同涂层体外细胞相容性；4、从大鼠腹主动脉采集3组新鲜血液：第1组、第2组新鲜血与清洁干燥的样品表面接触,分别加入一定量的蒸馏水、生理盐水孵育一定时间,然后收集溶液,利用分光光度计检测溶液吸光度值来评价样品表面动态凝血时间及溶血率；第3组新鲜血离心后收集富含血小板血浆,样品在富含血小板血浆中浸泡一定时间后洗净未黏附的血小板,经固定、脱水、置换及喷金处理后在扫描电镜下观察血小板黏附情况。以上测得的数据用以x±s表示,采用SPSS18.0软件对实验数据进行统计和分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、扫描电镜显示3组样品呈蜂窝状多孔表面,但HA、Ti+HA涂层的空隙更加均匀；X射线能谱仪分析显示HA、Ti+HA涂层主要由Ti、Ca、P、Si、O、C元素组成,而Ti涂层主要由Ti元素组成。2、大鼠BMSCs经全骨髓分离后,利用贴壁培养法培养,细胞生长状态良好,原代培养8天后铺满瓶底80%以上,传至第3代时细胞多呈梭形生长,细胞形态均一、生长旺盛,流式细胞仪对第3代大鼠BMSCs进行鉴定,结果显示第3代BMSCs表面抗体CD44、CD106阳性表达率分别为95.0%和81.1%,而造血类细胞表面标志CD45呈阴性,表达率为5.0%,符合作为实验细胞的基本标准。3、细胞体外相容性检测结果：3.1大鼠BMSCs与3组样品分别共同培养24、48h后,扫描电镜下可见材料与细胞复合培养24h后表面即有部分细胞黏附,Ti涂层表面的BMSCs呈圆形,而HA和Ti+HA涂层表面的细胞呈梭形或多角形；48h时可见HA和Ti+HA涂层表面的细胞开始铺展,尤其是在Ti+HA涂层表面,细胞呈多角形,并伸出细长的伪足伸入到材料的微孔内,与材料表面紧密粘附。3.2BMSCs与3组样品分别复合培养2-7d后,细胞分泌的ALP量呈上升趋势,3个观察时间点之间比较有统计学意义(P<0.05)；3种材料对BMSCs分泌ALP均有促进作用,诱导剂组、Ti涂层组组间比较无统计学意义(P>0.05); HA、Ti+HA涂层组组间比较无统计学意义(P>0.05); HA、Ti+HA涂层组与诱导剂组、Ti组两两比较,有统计学意义((P<0.05)。3.3BMSCs与3组样品分别复合培养2-7d后,50%、100%浸提液组吸光度值在各时间段与对照组两两比较,Ti涂层组与对照组比较,在第2d、第4d及第7d时P>0.05,无统计学差异；材料表面细胞相对增殖率在80～96%之间,材料毒性级别为1级；HA涂层组与对照组比较,在第2d时P>0.05,无统计学差异；第4d、7d时P<0.05,有统计学差异；材料表面细胞相对增殖率在89～114%之间,材料毒性级别为0～1级；Ti+HA涂层组与对照组比较,在第2d时P>0.05,无统计学差异；第4d、7d时P<0.05,有统计学差异；材料表面细胞相对增殖率在91～117%之间,材料毒性级别为0～1级。4、血液体外相容性检测结果：4.1动态凝血时间检测,由各个时间点检测的吸光度值结果绘制的折线图可见,HA、Ti+HA涂层组抗凝血效果优于Ti涂层组,在前30min时间段内优势比较明显,30min后时间段内差异稍缩小,但HA、Ti+HA涂层组抗凝血效果仍优于Ti涂层组。4.2溶血率检测,由各样品吸光度值结果绘制的柱状图可见,HA、Ti+HA涂层组溶血率小于Ti涂层组,且溶血率<1%,符合医学标准要求的植入物溶血率<5%的要求。4.3血小板黏附率检测,大鼠抗凝血离心后收集富含血小板血浆,与3组样品共同孵育1h后,经过处理后,扫描电镜下可见Ti涂层表面有一定量的血小板,且有伪足伸出；而HA、Ti+HA涂层组表面血小板数量很少,呈圆盘状,看不到明显的伪足伸出；HA、Ti+HA涂层有较好的血液相容性。结论：新型人工颈椎间盘终板表面喷涂的HA、Ti+HA涂层具有蜂窝状多孔表面,空隙均匀；大鼠BMSCs是良好的骨组织工程细胞,具有取材方便、易于扩增等优点；HA、Ti+HA涂层较Ti涂层具有良好的体外细胞相容性和血液相容性,本实验为假体涂层的初步筛选和改进提供了部分实验资料；后期还要制备其它涂层并进行筛选,以达到获得符合临床应用的最佳涂层的目的。

全文目录

目录  3-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
缩略语英汉对照  11-12
前言  12-14
综述一骨髓间充质干细胞在骨科应用的研究进展  14-25
  1 BMSCS的体外培养  14-15
  2 BMSCS的生物学特性  15
  3 BMSCS的成骨诱导分化  15-16
  4 BMSCS在骨科疾病中的应用  16-20
    4.1 肌腱修复  16-17
    4.2 骨缺损  17
    4.3 软骨修复  17-18
    4.4 脊髓损伤  18-19
    4.5 股骨头坏死  19-20
  5 问题与展望  20-22
  参考文献  22-25
综述二人工颈椎间盘置换治疗颈椎病研究进展  25-35
  1 颈椎病的分型及主要表现  25-26
    1.1 神经根型颈椎病  25
    1.2 脊髓型颈椎病  25-26
  2 颈椎病的手术治疗  26-27
  3 人工颈椎间盘的设计发展史及设计特点  27-29
    3.1 金属-金属假体  27
    3.2 金属-聚合物假体  27-29
  4 人工颈椎间盘治疗颈椎病  29-32
    4.1 PRESTIGE LP人工颈椎间盘  29
    4.2 BRYAN人工颈椎间盘  29-30
    4.3 PRODISC-C人工颈椎间盘  30
    4.4 DISCOVER人工颈椎间盘  30
    4.5 MOBI-C人工颈椎间盘  30-31
    4.6 不同人工颈椎间盘的纵向比较  31-32
  5 问题与展望  32-33
  参考文献  33-35
实验一新型人工颈椎间盘不同涂层表面特征的观察  35-44
  1 引言  35
  2 材料与方法  35-36
    2.1 主要仪器及设备  35
    2.2 新型人工颈椎间盘不同涂层的制备  35-36
    2.3 不同涂层表面特征的观察  36
  3 结果  36-39
    3.1 新型人工颈椎间盘假体的特征  36-37
    3.3 新型人工颈椎间盘不同涂层的特征  37-39
  4 讨论  39-42
    4.1 金属-聚合物摩擦界面  39-40
    4.2 生物活性涂层  40-41
    4.3 半限制型假体  41
    4.4 理想的影像兼容性  41-42
  参考文献  42-44
实验二大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定  44-57
  1 前言  44
  2 材料和方法  44-46
    2.1 所需试剂及仪器  44-45
    2.2 大鼠BMSCS的分离和培养  45
    2.3 大鼠BMSCS的传代  45-46
    2.4 大鼠BMSCS的鉴定  46
    2.5 大鼠BMSCS生长曲线的测定  46
  3 结果  46-52
    3.1 大鼠原代BMSCS培养结果  46-49
    3.2 大鼠BMSCS的传代  49-51
    3.3 大鼠BMSCS表面抗原的鉴定  51-52
    3.4 大鼠BMSCS生长曲线  52
  4 讨论  52-54
    4.1 BMSCS的分离、纯化  52-53
    4.2 BMSCS的生物学特性  53
    4.3 BMSCS的鉴定  53
    4.4 BMSCS在骨组织工程中的应用  53-54
  参考文献  54-57
实验三新型人工颈椎间盘不同涂层体外细胞相容性的实验研究  57-68
  1 前言  57
  2 材料和方法  57-59
    2.1 主要仪器和试剂  57
    2.2 涂层的表面处理及BMSCS的收集  57-58
    2.3 不同涂层对BMSCS黏附能力的影响  58
    2.4 不同涂层对BMSCS分泌ALP能力的影响  58
    2.5 不同涂层细胞毒性的检测  58-59
    2.6 统计学分析  59
  3 结果  59-63
    3.1 扫描电镜下涂层表面细胞黏附观察结果  59-60
    3.2 ALP活性测定结果  60-62
    3.3 不同涂层的细胞毒性  62-63
  4 讨论  63-65
    4.1 材料体外相容性的研究方法  63-64
    4.2 材料表面改性的必要性  64
    4.3 材料表面涂层制备方法的改进  64
    4.4 生物活性涂层的初步筛选  64-65
  参考文献  65-68
实验四新型人工颈椎间盘不同涂层体外血液相容性的实验研究  68-78
  1 前言  68
  2 材料和方法  68-69
    2.1 主要仪器及试剂  68
    2.2 动态凝血时间检测  68
    2.3 溶血率测定  68-69
    2.4 血小板黏附率测定  69
  3 结果  69-71
    3.1 各涂层动态凝血时间  69
    3.2 各涂层溶血率  69-70
    3.3 各涂层表面血小板黏附率  70-71
  4 讨论  71-75
    4.1 血液相容性的主要评价方法  71-72
    4.2 假体植入对血细胞影响的机制分析  72-73
    4.3 提高假体血液相容性的方法  73-74
    4.4 钛合金材料血液相容性的改进  74-75
  参考文献  75-78
致谢  78-80
个人简历  80

新型人工颈椎间盘不同涂层体外生物相容性的实验研究

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