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背景介绍糖尿病是一种以血糖增高为特征的多病因代谢疾病。大量的流行病学研究提示,糖尿病已是认知功能障碍的重要危险因素,主要以轻中度的认知功能受损为特征,同时伴有大脑结构、神经功能及神经精神等方面的病理性改变,其具体发病机制尚不明确。目前研究提示氧化应激在糖尿病中枢神经系统并发症中发挥重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体Y辅激活因子1α(PGC-1α)是新出现的在抗氧化应激系统中起关键作用的转录调节因子,在神经保护中发挥着重要作用,而沉默调节蛋白1(SIRT1)则可调节氧化应激条件下PGC-1α的起始和持续反应,对PGC-1α生物学效应的发挥起积极作用,被认为与PGC-1α共同构成了一个神经保护的调节系统。糖尿病慢性并发症,发病机制复杂多样,目前,控制和延缓糖尿病并发症,降低死亡率至关重要。然而现代医学尚缺乏理想药物及有效方法,最近,一些中药制剂在改善糖尿病并发症症状,增强体质等方面表现出了较好的疗效。糖尿病认知功能障碍,在中医学上,归属于“消渴”病合并呆病、健忘等范畴,病机是脏腑阴虚为本,病位在肺、脾、肾三脏,病久阴虚及阳,则三脏亏虚,功能失调,运化水湿功能减弱,加剧痰浊形成。故治疗的重点为健脾益气,消痰利湿。津力达颗粒以人参、黄精、苍术、苦参、麦冬、地黄、制何首乌、山茱萸、茯苓、佩兰、黄连、知母、淫羊藿(炙)丹参为成分,主要功用为益气养阴、健脾运津,用于气阴两虚证,具有治疗消渴之功效。由此,我们可以推测,津力达颗粒可能具有保护糖尿病患者认知功能的作用。目的本实验拟通过检测2型糖尿病大鼠脑组织海马区SIRT1和PGC-1α表达及氧化应激水平,同时观察大鼠海马组织的细胞凋亡及电镜下超微结构的变化情况,旨在探讨SIRT1和PGC-1α在糖尿病脑病发生发展中的作用机制。并观察不同剂量津力达颗粒对2型糖尿病大鼠海马组织的保护作用,检测其对SIRT1和PGC-1α表达及组织氧化应激水平的影响,从而为复方中药制剂津力达颗粒在治疗和延缓糖尿病认知功能障碍的临床应用上提供实验依据,并探讨其可能的机制。方法雄性SD大鼠88只,大鼠适应性饲养2d后随机分组,正常对照组12只给予普通饲料,其余各组大鼠均予高脂饲料,喂养4周。诱发出胰岛素抵抗模型后一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg;正常对照组给予同剂量的柠檬酸缓冲液腹腔注射。模型验证：2周后让大鼠禁食8h后行口服糖耐量试验,凡0min和120min血糖分别大于7.0mmol/L和11.0mmol/L的大鼠,作为2型糖尿病造模成功大鼠。本组造模成功大鼠74只,随机剔除2只,其余大鼠随机分为模型组、津力达低剂量组(0.75g/kg)、津力达中剂量组(1.5g/kg)、津力达高剂量组(3.0g/kg)、α-硫辛酸组(50mg/kg)、胰岛素组(诺和灵N,1.5U/kg),每组12只。除胰岛素采用皮下注射外,其他药物均采用0.5%羟甲基纤维素钠溶解均匀后灌胃给药。正常对照组与模型组均用同等体积的羟甲基纤维素钠灌胃。每日给药1次,连续处理2个月。8周后对各组大鼠行morris水迷宫检测其认知功能,应用RT-PCR技术,western blot方法分别检测各组海马组织中PGC-1α mRNA的表达及SIRT1及PGC-1α蛋白的表达,同时检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量；并行TUNEL凋亡染色观察其神经细胞损害情况及透射电镜检测其超微结构改变。结果1.各组大鼠一般情况正常对照组大鼠一般情况良好,精神状态佳,活动自如,毛发光泽,饮食及大小便正常,无死亡；模型组大鼠一般情况较差,精神萎靡,行动迟缓,毛发杂乱无光,出现多饮、多食、多尿现象。各药物组此种情况均有不同程度改善。2. Morris水迷宫测试结果与正常对照组相比,模型组潜伏期明显延长(P<0.05),各药物治疗组除津力达低剂量组较模型组潜伏期无明显改善外,其余组潜伏期均有不同程度的缩短(P<0.05),其中胰岛素组效果最为显著,与正常对照组比较,无显著差异(P>0.05)。其次为α-硫辛酸组及津力达高剂量组,其潜伏期较正常组有所延长(P<0.05),但与胰岛素组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。3.光镜检查结果正常对照组海马CA1区神经元排列较规则、紧密,细胞界限清楚,细胞带较完整；模型组海马CA1区细胞排列散乱,稀疏分布不均匀,神经细胞脱失严重,并可观察到比例较高的颜色棕染的凋亡细胞。各药物治疗组的情况较模型组均有不同程度的改善,其中津力达中、高剂量组、a-硫辛酸组及胰岛素组改善显著。4.透射电镜检查结果正常对照组细胞核染色质分布较均匀,大部分线粒体结构完整,偶见线粒体嵴破坏；模型组细胞结构欠清晰,细胞核有凝集现象,有较多线粒体结构不完整,线粒体嵴破坏；津力达低剂量组部分细胞核染色质凝集,部分细胞核染色质分布不均匀,大部分线粒体结构完整,少量线粒体嵴破坏。津力达中剂量组部分细胞核染色质聚集,呈块状,大部分线粒体结构完整,少量线粒体嵴破坏。津力达高剂量组染色质凝集在细胞核边缘,分布不均匀,部分线粒体嵴破坏。α-硫辛酸组染色质呈块状凝集,凝集的染色质主要分布在细胞核边缘,部分线粒体嵴破坏。胰岛素组部分细胞核染色质分布较均匀,部分细胞核染色质凝集,部分线粒体破坏,胞质内有少量空泡。5.自由基及抗氧化酶指标检测结果与正常对照组相比,模型组超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量明显降低,丙二醛(MDA)含量增多,各药物治疗组可不同程度的提高组织抗氧化酶的含量,降低MDA含量,其中以胰岛素、α-硫辛酸、津力达高剂量组效果显著。津力达高剂量组能明显提高海马组织SOD水平,其效果与α-硫辛酸相媲美(P<0.05),但比胰岛素略差；对于GSH,津力达高剂量组能明显增加其水平,其效果比α-硫辛酸、胰岛素略差,对于MDA水平,胰岛素组效果最为显著,其次为α-硫辛酸,津力达高剂量组和中剂量组效果相当(P<0.05)。6.各组大鼠海马组织PGC-1α mRNA表达量及PGC-1α、SIRT1蛋白表达量模型组与正常组相比,其PGC-1α mRNA及SIRT1、PGC-1α蛋白表达量均明显降低(P<0.05),各药物治疗组均能不同程度提高PGC-1α mRNA及SIRT1蛋白的含量(P<0.05),其中以胰岛素、α-硫辛酸及津力达高剂量组效果最为显著。而PGC-1α蛋白的表达,与模型组相比较,α-硫辛酸及胰岛素能够明显提高其蛋白含量,津力达中高剂量组虽有一定程度增高,但差异无统计学意义,不过津力达高剂量组的效果仍明显优于低、中剂量组(P<0.05)。结论2型糖尿病可使大鼠出现明显的认知功能障碍,其海马组织结构明显破坏,细胞凋亡严重。海马组织PGC-1α mRNA及其蛋白、SIRT1蛋白的表达量明显下调,而抗氧化酶SOD、GSH表达降低,MDA水平上调。津力达颗粒可改善2型糖尿病大鼠的认知功能障碍,并保护其海马组织,其疗效与α-硫辛酸相媲美。津力达的神经保护作用,可能部分是通过调节SIRT1/PGC-1α,继而调节抗氧化酶及线粒体的生物合成而实现的。
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