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菩人丹对糖脂毒导致的INS-1细胞损伤的修复作用及机制研究

作　者: 鲁碧楠
导　师: 庞宗然
学　校: 中央民族大学
专　业:
关键词: 菩人丹胰岛β细胞“质”与“量” 糖脂毒增殖与凋亡胰岛素IRS2/PI3K/Akt通路
分类号: R587.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

[背景]2型糖尿病是严重危害人类健康的重大疑难疾病。胰岛p细胞功能的衰竭和胰岛素抵抗是其主要发病机制,其中胰岛p细胞数量的异常减少和胰岛素分泌功能的下降是导致2型糖尿病发生和发展的关键因素。葡萄糖和脂肪虽然是机体必需的营养物质,但是长期高水平的葡萄糖和游离脂肪酸将造成胰岛p细胞损伤,致使细胞发生凋亡并逐步丧失胰岛素分泌的功能,最终导致2型糖尿病的不可逆发生。而胰岛p细胞上的胰岛素信号转导通路,调控着p细胞的增殖、分化和胰岛素的合成、分泌,在机体糖脂代谢中发挥着重要作用。我国传统中医药治疗糖尿病已有上千年的历史,中药复方多靶点、多途径的作用特点,以及较少的毒副作用,在预防糖尿病发生以及并发症出现方面具有显著优势。[目的]本实验试图通过体外实验研究,证实高浓度葡萄糖、软脂酸及软脂酸+高糖对胰岛p细胞的损伤作用及其差异。在此基础上考察“益气养阴清热、活血化瘀通络”中药复方菩人丹对胰岛p细胞活力、凋亡以及胰岛素分泌的影响,阐明菩人丹保护胰岛p细胞“质”“量”之功效,并从分子水平研究菩人丹对胰岛p细胞胰岛素信号转导中IRS2/PI3K/Akt通路的影响,揭示菩人丹修复“糖脂毒”导致的胰岛p细胞损伤的作用机制。[方法]选取大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞为胰岛p细胞的体外研究对象,以33.3mM葡萄糖、0.5mM软脂酸及0.5mM软脂酸合并33.3mM葡萄糖分别构建糖毒性、脂毒性及糖脂毒性p细胞损伤模型。在各损伤模型基础上,分别给予5%菩人丹含药血清、10%菩人丹含药血清干预24小时,并以10%二甲双胍含药血清为阳性对照。采用CCK-8试剂盒检测INS-1细胞活力；Hoechst荧光染色法和流式Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；caspase-3和caspase-8活性检测试剂盒检测细胞caspase-3/-8活性；葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测INS-1细胞的胰岛素分泌；采用Western blot法分析胰岛素信号转导通路相关蛋白IRS2、Akt、BAD、FOXO1、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白质表达水平,以及IRS2(ser731)、Akt(thr308)、BAD(serl36)、 FOXO1(ser256)、mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)的磷酸化水平。[结果]1.三种模型的特点和胰岛素分泌功能变化规律：(1)33.3mM葡萄糖作用于INS-1细胞,12小时后,与对照组比较细胞活力(P=0.013)和细胞BIS以及GSIS均显著升高(BIS:P<0.001, GSIS: P=0.046);培养24小时后,细胞活力和胰岛素分泌出现下降(P<0.001),其降低呈现时间依赖性；此时出现明显的细胞凋亡(P<0.001)。(2)0.5mM软脂酸作用于INS-1细胞,6小时后细胞活力即开始下降,但此时细胞BIS有所升高,然而二者变化均无统计学意义(P>0.05)；培养24小时后,细胞活力和GSIS均明显降低(P<0.001),但BIS则明显升高(P=0.001)；同时观察到明显的细胞凋亡(P<0.001),且凋亡率大于高糖损伤细胞。(3)0.5mM软脂酸和33.3mM葡萄糖同时作用于INS-1细胞,6小时后,细胞活力和GSIS即出现显著降低(细胞活力：P=0.041; GSIS:P<0.001),细胞BIS在12小时后也开始显著下降(P<0.001),其下降呈现时间依赖性；细胞凋亡率则远高于单纯高糖组和软脂酸组。2.菩人丹对糖脂损伤INS-1细胞的保护作用：(1)菩人丹对糖脂损伤INS-1细胞的活力影响：高糖、软脂酸、软脂酸+高糖均使INS-1细胞活力显著降低(vs.对照组,P<0.001)。低剂量菩人丹对损伤细胞的活力无明显作用(vs.模型组,P>0.05),而高剂量菩人丹可使细胞活力明显升高(vs.模型组,P=0.003或P<0.001),作用效果与阳性对照药二甲双胍相当。(2)菩人丹对糖脂损伤INS-1细胞凋亡的影响：高糖、软脂酸、软脂酸合并高糖均明显促进INS-1细胞的凋亡(vs.对照组,P<0.001),升高caspase-3和caspase-8的活性。低剂量菩人丹对细胞凋亡无明显作用(vs.模型组,P>0.05),而高剂量菩人丹可显著降低caspase-3和caspase-8的活性,抑制细胞凋亡(vs.模型组,P<0.001),并与阳性对照药二甲双胍作用效果相当。(3)菩人丹对糖脂损伤INS-1细胞胰岛素分泌的影响：高糖、软脂酸合并高糖使INS-1细胞的BIS和GSIS降低(vs.对照组,P<0.001),而软脂酸使INS-1细胞GSIS降低的同时(vs.对照组,P<0.001),使BIS升高(vs.对照组,P=0.012)。低剂量菩人丹对细胞胰岛素分泌无显著影响(vs.模型组,P>0.05),而高剂量菩人丹可明显增加糖脂损伤INS-1细胞的BIS及GSIS(vs.模型组,P<0.001),对软脂酸导致的细胞BIS上升虽有所抑制,但差异无统计学意义(vs.模型组,P=0.099)。菩人丹对糖脂损伤INS-1细胞胰岛素分泌的作用效果与二甲双胍相当。3.菩人丹对INS-1细胞胰岛素信号转导通路的影响：高糖、软脂酸、软脂酸合并高糖均可显著下调IRS2蛋白质表达水平(P<0.001),降低Akt(thr308)、B AD(ser136)、FOXO1(ser256)、mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)的磷酸化水平(P<0.001),上调FOXO1和PTP1B的蛋白质表达,升高IRS2(ser731)磷酸化水平(P<0.001)。菩人丹干预24小时后,促进了各损伤模型细胞IRS2的蛋白表达(P<0.001)以及Akt(thr308)、 BAD(ser136)、FOXO1(ser256)、mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)的磷酸化(P<0.001),同时抑制了FOXO1和PTP1B的蛋白质表达(P<0.001)以及IRS2(ser731)的磷酸化(P<0.001),并且与阳性对照药二甲双胍作用效果相当。[结论]1.高浓度葡萄糖在短时间内可以促进INS-1细胞的增殖和胰岛素分泌,而持续高糖则表现出促进细胞凋亡、抑制细胞活力和胰岛素分泌的作用,并且对GSIS的影响较BIS更为显著；软脂酸可抑制INS-1细胞活力,促进细胞凋亡,并且在短时间内可轻微增加胰岛素分泌,但长时间作用表现为增加细胞BIS而抑制GSIS;软脂酸合并高糖可抑制INS-1细胞活力、促进细胞凋亡、降低胰岛素分泌,且作用强于单纯高糖和软脂酸,对INS-1细胞的损伤具有协同性和叠加性。2.菩人丹可以显著抑制糖毒性、脂毒性和糖脂毒性导致的胰岛p细胞凋亡、提高细胞活力、降低caspase-3和caspase-8活性、促进p细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌,保护p细胞的“质”和“量”,从而发挥菩人丹“益气养阴清热、活性化瘀通络”治疗2型糖尿病之功效。3.菩人丹可以减少“糖脂毒”损伤INS-1细胞IRS2蛋白的异常降解和丝氨酸(ser731)磷酸化,保证足量的IRS2可以被胰岛素受体的酪氨酸激酶活化,继而减轻糖脂毒对胰岛p细胞Akt活性的抑制作用,使Akt苏氨酸(thr308)磷酸化增强,激活胰岛素信号转导系统中的PI3K/Akt通路,将胰岛素信号继续向下游传递,使下游效应因子BAD、FOXO1、mTOR和P70s6k被活化,得以发挥其各自的生物学功能,从而抑制“糖脂毒”对胰岛p细胞凋亡的促进作用、修复“糖脂毒”导致的胰岛素分泌损伤,改善“糖脂毒”损伤p细胞的“质”“量”。

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摘要  3-8
ABSTRACT  8-13
目录  13-15
CONTENTS  15-17
序言  17-19
第一章糖脂毒导致INS-1细胞损伤的模型构建与评价  19-43
  前言  19-22
  1.1 材料与方法  22-28
    1.1.1 实验材料  22-23
    1.1.2 实验方法  23-28
  1.2 实验结果  28-34
    1.2.1 大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞培养  28
    1.2.2 糖脂毒对INS-1细胞活力的影响  28-30
    1.2.3 糖脂毒对INS-1细胞凋亡的影响  30-31
    1.2.4 糖脂毒对INS-1细胞胰岛素分泌功能的影响  31-34
  1.3 讨论  34-39
    1.3.1 糖毒性对β细胞的损害  34-36
    1.3.2 脂毒性对β细胞的损害  36-38
    1.3.3 糖脂毒性对β细胞的损害  38-39
  1.4 结论  39-40
  参考文献  40-43
第二章菩人丹对糖脂毒导致的INS-1细胞损伤的修复作用研究  43-79
  前言  43-47
  2.1 材料与方法  47-54
    2.1.1 实验材料  47-49
    2.1.2 实验方法  49-54
  2.2 实验结果  54-70
    2.2.1 大鼠血清对INS-1细胞的细胞毒作用  54-55
    2.2.2 菩人丹含药血清成分HPLC-MS分析  55-57
    2.2.3 菩人丹对高糖诱导INS-1细胞损伤的保护作用  57-61
    2.2.4 菩人丹对软脂酸诱导INS-1细胞损伤的保护作用  61-66
    2.2.5 菩人丹对软脂酸合并高糖诱导INS-1细胞损伤的保护作用  66-70
  2.3 讨论  70-75
    2.3.1 菩人丹血清药理学  70-71
    2.3.2 菩人丹改善糖脂毒损伤β细胞的“质”和“量”  71-73
    2.3.3 菩人丹修复胰岛β细胞损伤机制  73-75
  2.4 结论  75-76
  参考文献  76-79
第三章菩人丹对糖脂毒损伤的INS-1细胞胰岛素信号转导通路的作用研究  79-105
  前言  79-82
  3.1 材料与方法  82-88
    3.1.1 实验材料  82-85
    3.1.2 实验方法  85-88
  3.2 实验结果  88-95
    3.2.1 菩人丹对糖脂毒损伤的INS-1细胞IRS2表达及磷酸化的影响  88-89
    3.2.2 菩人丹对糖脂毒损伤的INS-1细胞Akt表达及磷酸化的影响  89-90
    3.2.3 菩人丹对糖脂毒损伤的INS-1细胞BAD表达及磷酸化的影响  90-91
    3.2.4 菩人丹对糖脂毒损伤的INS-1细胞FOXO1表达及磷酸化的影响  91-93
    3.2.5 菩人丹对糖脂毒损伤的INS-1细胞mTOR/P70s6k表达及磷酸化的影响  93-94
    3.2.6 菩人丹对糖脂毒损伤的INS-1细胞PTP1B表达的影响  94-95
  3.3 讨论  95-101
    3.3.1 胰岛素受体底物  96-97
    3.3.2 PI3K及其下游信号分子  97-101
  3.4 结论  101-102
  参考文献  102-105
结论  105-106
文献综述  106-118
  综述一胰岛β细胞“质”、“量”的辩证关系——“质”的三要素  106-111
    参考文献  110-111
  综述二胰岛β细胞“质”、“量”的辩证关系——β细胞“量”与T2DM  111-118
    参考文献  116-118
致谢  118-119
攻读学位期间发表的学术论文目录  119

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