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NF-κB“诱饵”寡核苷酸对TNBS诱导小鼠慢性肠纤维化的影响及疗效观察

作　者: 张静
导　师: 李弼民
学　校: 南昌大学医学院
专　业: 内科学
关键词: 炎症性肠病三硝基苯磺酸肠纤维化 NF-κB“诱饵”寡核苷酸
分类号: R574
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景：炎症性肠病（IBD）的病因及发病机制尚不明确，是一类慢性非特异性肠道炎性疾病，发病率日益增多，受到了越来越多的关注。IBD包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），两者均具有慢性、反复发作、迁延不愈的特点，临床表现也相似，如腹泻、便血、消瘦等。肠纤维化是IBD发病过程中常见的严重并发症，可引起肠壁狭窄，最终导致肠梗阻。目前认为IBD的发病与环境、感染、遗传、免疫、非甾体抗炎药、抽烟等多因素相互作用有关。迄今为止，传统药物治疗包括抗生素、氨基水杨酸类、肾上腺糖皮质激素以及免疫抑制剂，但疗效有限，副作用大，患者依从性差；新型药物主要为生物制剂如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的单抗，但长期使用的安全性问题尚存争议。无论传统药物还是新型药物，对于IBD炎症及纤维化的疗效都不尽如人意，因此探讨IBD发病机制，寻找新型有效的治疗药物及确定治疗疗程是本领域目前研究的一个热点。现研究表明，核转录因子κBp65（NF-κBp65）在IBD的发生发展中起到重要作用，可以调控多种炎性因子的释放，已成为IBD治疗的新靶点。NF-κBp65“诱饵”寡核苷酸（Decoy ODN）可阻断NF-κBp65的表达，导致相应靶基因丧失转录功能，减少细胞因子的释放，成为IBD治疗的新方向。本实验通过合成NF-κBp65Decoy ODN作为干预手段，对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的动物模型进行干预，为NF-κBp65Decoy ODN治疗IBD提供理论依据。研究目的：探讨NF-κBp65Decoy ODN干预灌肠对TNBS/50%乙醇（EtOH）诱导动物模型的影响，并研究NF-κBp65Decoy ODN治疗的最佳治疗疗程。通过观察各组实验小鼠的疾病活动指数（DAI），分析研究结肠组织学病理变化，胶原纤维的增生程度，IL-1β、TNF-α、Col-ⅢmRNA的表达水平，NF-κBp65、TGF-β1的蛋白表达水平，进而研究NF-κBp65Decoy ODN在治疗TNBS诱导小鼠肠道炎症及肠纤维化中的作用机制，为NF-κBp65Decoy ODN治疗IBD提供理论依据。研究方法：1.IBD动物模型建立实验开始前24小时禁食不禁水，灌肠时持3.5F导管，从肛门插入肠道深约5.5cm，给予2mg TNBS/50%EtOH100ul灌肠，将小鼠倒置60秒。连续6周，每周1次。2.实验分组将80只体重约20-25克，6-8周龄，雌性BALB/C小鼠随机分成8组，每组10只，分别为：空白组，TNBS组，MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组，Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组。（1）空白组：每周给予NS100ul灌肠2次，连续6周，每周2次；（2）TNBS组：按上述方法造模，每周TNBS灌肠24小时后给予NS100ul灌肠；（3）MSODNⅠ组：按上述方法造模，第一到二周TNBS灌肠24小时后给予MSODN100ul灌肠，其余四周均给予NS灌肠；（4）MSODN Ⅱ组：按上述方法造模，第一到四周TNBS灌肠24小时后给予MSODN100ul灌肠，其余二周均给予NS灌肠；（5）MSODN Ⅲ组：按上述方法造模，每周TNBS灌肠24小时后给予MSODN100ul灌肠；（6）Decoy ODNⅠ组：按上述方法造模，第一到二周TNBS灌肠24小时后给予Decoy ODN100ul灌肠，其余四周均给予NS灌肠；（7）Decoy ODN Ⅱ组：按上述方法造模，第一到四周TNBS灌肠24小时后给予Decoy ODN100ul灌肠，其余二周均给予NS灌肠；（8）Decoy ODN Ⅲ组：按上述方法造模，每周TNBS灌肠24小时后给予DecoyODN100ul灌肠。3.观察指标和检测方法所有实验小鼠于最后一次灌肠1周后，颈椎脱臼法处死小鼠，取结肠组织，HE染色评估小鼠结肠炎症程度，VG染色评估小鼠结肠纤维化程度，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测IL-1β、TNF-α及Col-ⅢmRNA的表达水平，免疫组织化学检测小鼠结肠组织NF-κBp65、TGF-β1的蛋白表达水平。结果：1.一般情况及DAI评分：空白组小鼠，实验期间小鼠饮食正常，活动自如，毛发光泽，无死亡；TNBS组、MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠，每周灌肠后，3天内出现少食，体重减轻，少动，毛发无光泽，腹泻，大便潜血甚至肉眼血便，4天后不良症状逐渐减轻，实验期间，不良症状以3-4周较明显，之后症状趋于稳定，死亡集中在第3周；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠，每周灌肠后，均会出现上述不良症状，但程度较轻，其中Decoy ODN Ⅲ组程度最轻，3天内症状明显，之后逐渐恢复，实验期间，不良症状以3-4周较明显，无死亡。各组实验小鼠DAI评分，不同时间段内比较，空白组无统计学意义（P>0.05）；TNBS组，MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组，有统计学意义（P<0.05）；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组由于治疗疗程不同，对小鼠DAI评分影响并不全都有统计学意义。在相同时间段内，空白组相对于其它实验组小鼠，DAI评分低，有统计学意义（P<0.01）；TNBS组与MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组比较，无统计学意义（P>0.05）；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组与TNBS组、MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组比较，DAI评分低，有统计学意义（P<0.05）。Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组之间由于治疗疗程不同，对小鼠DAI评分影响并不全都有统计学意义。2.大体观察及病理表现：肉眼观察空白组小鼠结肠组织呈淡红色，无特殊改变；TNBS组、MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠，可见结肠肠管变形，肠壁增厚粘连，可见明显充血、水肿，糜烂、溃疡，甚至出现结节；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组亦可见上述改变，但症状较轻，且肠壁无明显变形、增厚粘连，其中DecoyODN Ⅲ组程度最轻。病理表现，空白组小鼠无特殊病理学改变，TNBS组、MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠，HE染色可见炎症表现，如细胞结构紊乱，腺体破坏、隐窝破坏、炎性细胞浸润；VG染色可见纤维化表现，如黏膜下和浆膜层出现大量的粉红色胶原纤维增生，固有肌层明显增厚。Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组亦可见上述病理学改变，但炎症及纤维化程度较轻，其中Decoy ODN Ⅲ组程度最轻。各组实验小鼠肠炎症及纤维化评分，空白组相对于其它实验组评分低，有统计学意义（P<0.01）；TNBS组与MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组比较，无统计学意义（P>0.05）；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组与TNBS组、MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组比较评分低，有统计学意义（P<0.05）；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组三组之间亦有统计学意义（P<0.05），其中Decoy ODN Ⅲ组评分最低。3.小鼠结肠IL-1β、TNF-α、Col-Ⅲα mRNA的表达水平：空白组相对于其它实验组三项mRNA表达低，有统计学意义（P<0.01）；TNBS组与MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组比较，无统计学意义（P>0.05）；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组与TNBS组、MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组比较，三项mRNA表达低，有统计学意义（P<0.05）；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组三组之间亦有统计学意义（P<0.05），其中Decoy ODNⅢ组三项mRNA表达最低。4.小鼠结肠NF-κBp65、TGF-β1蛋白表达变化：空白组相对于其它实验组，NF-κBp65、TGF-β1蛋白表达低，有统计学意义（P<0.01）；TNBS组与MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组比较，无统计学意义（P>0.05）；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组与TNBS组、MSODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组比较，NF-κBp65、TGF-β1蛋白表达低，有统计学意义（P<0.05）；Decoy ODNⅠ、Ⅱ、Ⅲ组三组之间亦有统计学意义（P<0.05），其中Decoy ODN Ⅲ组NF-κBp65、TGF-β1蛋白表达最低。结论：1.通过对各组小鼠的DAI、结肠大体、病理及纤维化评分的对比观察，证实2mg TNBS/50%EtOH灌肠可成功诱导小鼠肠道炎症及肠纤维化的形成。2.NF-κBp65Decoy ODN连续用药6周治疗小鼠肠道炎症及纤维化疗效最为显著，NF-κBp65MSODN则无治疗效果。3.NF-κBp65Decoy ODN治疗小鼠结肠的炎症及纤维化的作用机制是下调TNF-a、IL-1β、Col-Ⅲα mRNA表达，抑制NF-κBp65、TGF-β1蛋白表达，NF-κBp65Decoy ODN有望成为治疗IBD的新型药物。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-16
第1章引言  16-18
第2章材料与方法  18-33
  2.1 材料  18-20
    2.1.1 实验动物  18
    2.1.2 主要仪器  18-19
    2.1.3 试剂和药品  19-20
  2.2 实验方法  20-32
    2.2.1 主要溶液的配制  20-22
    2.2.2 BALB/C 小鼠模型建立及分组  22-23
    2.2.3 标本的获取及处理  23-24
    2.2.4 病活动指数（DAI）评估  24-25
    2.2.5 HE 染色观察小鼠结肠组织病理改变  25-26
    2.2.6 VG 染色观察肠纤维化程度  26-27
    2.2.7 RT-PCR 检测结肠组织 TNF-α、IL-1β、Col-Ⅲ mRNA 表达  27-30
    2.2.8 免疫组织化学检测结肠组织 NF-κBp65 和 TGF-β1 蛋白的表达  30-32
  2.3 统计分析方法  32-33
第3章结果  33-51
  3.1 各组小鼠的一般情况、生存率及 DAI 评分  33-36
  3.2 各组小鼠结肠组织的大体观察及病理表现  36-41
    3.2.1 各组小鼠结肠组织的大体形态  36-38
    3.2.2 镜下观察各组小鼠结肠组织 HE 染色  38-41
  3.3 镜下观察各组小鼠结肠组织 VG 染色  41-43
  3.4 各组小鼠结肠 IL-1β、TNF-α、Col-Ⅲα mRNA 的表达水平  43-45
  3.5 各组小鼠结肠组织中 NF-κBp65 蛋白表达的变化  45-48
  3.6 各组小鼠结肠组织中 TGF-β1 蛋白表达的变化  48-51
第4章讨论  51-58
  4.1 IBD 动物模型  51-52
  4.2 NF-κBp65 与 IBD  52-53
  4.3 细胞因子与 IBD  53-55
  4.4 Col-Ⅲα与肠纤维化  55
  4.5 Decoy ODN 与 IBD  55-56
  4.6 NF-κBp65 Decoy ODN 治疗疗程的选择  56-58
第5章结论  58-59
致谢  59-60
参考文献  60-63
攻读学位期间的研究成果  63-64
综述1  64-73
  参考文献  70-73
综述2  73-80
  参考文献  78-80

NF-κB“诱饵”寡核苷酸对TNBS诱导小鼠慢性肠纤维化的影响及疗效观察

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