|
研究背景：慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种严重危害人类健康的常见病和多发病,其肺功能常呈进行性减退,通气和换气功能障碍可导致缺氧和二氧化碳潴留,发生不同程度的低氧血症和高碳酸血症,引起进行性的肺动脉高压。在肺动脉高压发病机制及治疗方面,血管内皮细胞起着极为重要的作用。国内外多项研究表明,缺氧可导致内皮细胞收缩,细胞间距增大,血管通透性增高；缺氧可导致内皮细胞屏障功能受损,不但加重了组织细胞的缺氧,还使得炎症细胞过多聚集于局部组织,直接造成组织细胞损伤；缺氧还可导致肺血管内皮细胞分泌的血管活性物质出现平衡失调,内皮结构受损及凝血异常等。内皮细胞损伤是PH的起始环节,而肺血管收缩增强和肺血管结构重建被认为是内皮细胞受损后出现的主要血管变化特征。上述因素单独或相互作用,导致肺动脉高压进一步加重。而肺动脉高压一旦形成,肺心病就可能接踵而至。近年来对低氧反应通路的研究越来越深入,目前所发现的介导机体和局部组织缺氧反应最关键的特异性中介因子之一的低氧诱导因子-la(HIF-1α),广泛参与哺乳动物细胞中低氧诱导的特异应答,是低氧条件下高表达的具有转录活性的核蛋白,在低氧性肺损伤中具有重要作用。HIF-1α是一个异源二聚体,由对氧敏感的α亚基和稳定表达的p亚基组成。HIF-1α的表达直接与细胞内氧分压有关,常氧下HIF-1α迅速降解,而在低氧环境下HIF-1α蛋白迅速积累,可呈指数形式增高,并启动了多种低氧适应的基因转录,如内皮素-1(ET-1)、促红细胞生成素(EPO)等。在这些基因的启动子、增强子或其他调控区域均含有HIF-1a的特异结合序列。在肺代谢中,内皮素是目前已知作用最强、持续最久的缩血管活性多肽,它具有收缩血管、促进生长因子和粘连分子的释放和表达、刺激细胞外基质蛋白和纤维连接蛋白的产生等多种生物学作用,它不仅参与血管的张力调节,而且参与低氧条件下的肺动脉重构,在肺动脉高压的形成中具有重要的调节作用。国内外动物研究发现,当暴露于低氧高二氧化碳环境(模拟COPD环境)下,大鼠血浆ET-1浓度较正常对照组明显升高,原位杂交发现,慢性低氧高二氧化碳组大鼠肺动脉ET-1mRNA表达较正常对照组明显增强。因此推测肺动脉ET-1的合成分泌增多可能为慢性低氧高二氧化碳引起肺动脉高压和肺血管结构重建的重要原因。前列环素(PGI2)主要由内皮细胞分泌,具有强大的扩张血管,抑制血小板聚集及细胞黏附的作用,因此PGI2不仅能预防血栓形成,还能直接作用于平滑肌细胞,进而促使血管扩张；此外,它还能拮抗内皮素的生成和分泌,抑制血小板聚集,抑制细胞的移行和增殖作用。低氧高二氧化碳环境可以引起内皮细胞功能障碍,导致其分泌的血管活性物质失衡,最终促进肺动脉高压的发生、发展。因此,应用药物或其他干预因素改善血管内皮细胞的功能,在低氧性肺动脉高压治疗中起着重要的作用。目前在调整内皮细胞功能方面,主要有以下方面的进展：(1)ET受体拮抗剂,目前此药在肺动脉高压的治疗中已取得较好的临床疗效,它使得人们从简单的扩肺血管治疗转移到控制肺血管重塑上；(2)一氧化氮(NO)及其前体,可减轻内皮细胞损伤以及扩张血管平滑肌细胞；(3)前列环素类药物,增加细胞内环磷酸腺苷的浓度,直接发挥扩血管作用,并抑制血管平滑肌细胞增殖；(4)血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂,可改善NO介导的内皮细胞功能的药物：(5)钙离子拮抗剂,可增强NO舒张平滑肌的作用,抑制ET-1的缩血管作用,并有一定抗氧化作用,可保护内皮细胞功能；(6)中医中药,其中川芎、丹参、汉防己甲素等,已有动物实验证明均存在减轻缺氧性肺动脉高压中血管内皮损伤的作用；(7)内皮祖细胞种植和基因治疗。总之,随着对肺血管内皮细胞在肺动脉高压形成中地位认识的不断提高,保护肺血管内皮细胞功能已成为治疗肺动脉高压的重要目标之一。益肺活血复方制剂(YFHXC)是我国著名中医内科学家董建华院士多年来治疗肺心病的经验性中药复方,其疗效经多年临床实践已得到证实。既往研究表明,在动物实验水平上,YFHXC可抑制肺血管中膜增厚、减轻血管缩窄、降低肺动脉高压；在细胞水平上YFHXC可以抑制体外低氧下培养的大鼠平滑肌增殖及促进NO生成。而COPD患者常常在肺泡低氧的同时伴有二氧化碳潴留,而且二氧化碳潴留在肺动脉高压形成中起着一定的作用。因此我们实验中采用低氧高二氧化碳条件来作用于人肺动脉内皮细胞(HPAECs),并观察此条件下HPAECs形态、内分泌功能的变化及YFHXC对HPAECs的作用。目的：研究低氧高二氧化碳对人肺动脉内皮细胞分泌HIF-1α、ET-1和PGI2的影响及益肺活血复方制剂的保护机制。方法：1.制备益肺活血复方制剂：生药的原材料由北京市卫生局临床药物研究所鉴定审核,制作方法：把生药原材料放入重蒸水煎沸,每次3小时,合并2次滤液,4000r/min离心15min后取上清液,浓缩,制成益肺活血复方制剂,浓缩至含生药1g/ml浓度。2.制备含药血清：选择新西兰大耳白兔20只,随机分为4组：生理盐水组,益肺活血复方制剂低浓度组、益肺活血复方制剂中浓度组、益肺活血复方制剂高浓度组(分别为生药10、20、40g/kg),每组5只。采用血清药理学方法,各组分别以生理盐水和低、中、高浓度益肺活血复方连续灌胃7天,每天两次(灌胃前禁食不禁水12小时)。末次灌胃给药2小时后,腹主动脉无菌采血,室温静置2小时,离心后分离血清,合并同组含药血清,56℃灭活30分钟,用0.22μm微孔滤膜过滤,分装,-80℃保存备用。3.采用贴壁法培养HPAECs:将HPAECs细胞株复苏,每隔一天更换培养液一次,待瓶底覆盖约80%,以胰蛋白酶消化传代培养,选用生长良好的3-5代细胞进行试验。HPAECs随机分为空白对照组、模型组、低氧高二氧化碳+益肺活血复方制剂含药血清低、中、高浓度组。4.亲和素-生物素复合体法(SABC)测定HIF-1α蛋白含量：将细胞以4×104/孔接种于6孔板中制作细胞爬片,用PBS洗每个孔两次,加4%多聚甲醛固定30min,再用PBS洗3次,3%双氧水及血清室温封闭20min；依次滴加一抗、生物素化二抗、试剂SABC,最后采用DAB试剂显色。5.放射免疫分析法测定细胞上清液中的ET-1：将细胞以4×104/孔接种于6孔板中,各组细胞按试验分组处理12小时后,收取各组细胞培养液上清,置于-20℃冰箱储存备测。6.放射免疫分析法测定细胞上清液中PGI2：按照以上方法接种细胞,各组细胞按试验分组处理12小时后,收取各组细胞培养液上清,置于-20℃冰箱储存备测。7. RT-PCR法测定ET-1mRNA表达：按照以上方法准备细胞,各组细胞按试验分组处理12小时后,收集各组细胞。按照总RNA提取试剂盒提取总RNA,利用紫外分光光度计检测RNA浓度,A260/A280=1.8-2.0,可以进行逆转录；用琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整度。取lugRNA按照逆转录-多聚酶链反应试剂盒说明合成cDNA,并进行PCR反应；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。8.所有数据用均数x±标准差(x±S)表示。用SPSS13.0统计学软件进行分析,组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间多重比较用LSD检验。其中P<0.05认为差异有统计学意义。结果：1.空白对照组细胞的细胞核内几乎未表达HIF-1a蛋白,模型组细胞核内HIF-1α蛋白表达较空白对照组明显增多(n=6,P<0.01)；低、中、高浓度益肺活血复方制剂含药血清组与模型组相比,低浓度组细胞核内HIF-la蛋白表达较模型组无明显变化(n=6,P>0.05)；而中、高浓度含药血清组细胞核内HIF-1α蛋白的表达较模型组显著降低,且有统计学意义(n=6,P<0.05)。2.空白对照组细胞可分泌一定量的ET-1,模型组分泌的ET-1明显高于空白对照组(P<0.01);与模型组相比,低浓度益肺活血复方制剂含药血清组分泌的ET-1含量较模型组无明显变化(P>0.05),而中、高浓度含药血清组细胞分泌到培养液中的ET-1含量较模型组明显减少,且结果具有统计学意义(P<0.01)。3.模型组分泌的PGI2明显低于空白对照组(P<0.01),与模型组相比,低浓度益肺活血复方含药血清组分泌的PGI2含量较模型组无明显变化(P>0.05),而中、高浓度含药血清组细胞分泌到培养液中的PGI2含量较模型组明显增多,‘且结果具有统计学意义(P<0.01)。4.空白对照组细胞表达较少量的ET-1mRNA,模型组细胞ET-1mRNA的表达显著升高,与空白对照组比较有统计学意义(n=6,P<0.05)；低、中、高益肺活血复方制剂含药血清组与模型组相比,低浓度含药血清组的表达较模型组无明显变化：中、高浓度含药血清组细胞内ET-1mRNA的表达较模型组明显减少(P<0.05)。结论：低氧高二氧化碳环境下HPAECs核内HIF-1α蛋白、ET-1mRNA的表达及其分泌的ET-1增多,但HPAECs分泌的PGI2减少。低氧高二氧化碳可导致HPAECs功能紊乱,而中、高浓度的YFHXC含药血清可减少HPAECs HIF-la蛋白、ET-1mRNA的表达和ET-1的分泌,增加PGI2的分泌,从而减轻HPAECs功能紊乱。YFHXC可能通过减轻低氧高二氧化碳环境引起的HPAECs功能紊乱程度,进而在肺动脉高压的治疗中发挥一定作用。
|