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蜕皮甾酮对急性肺损伤大鼠肺组织中TNF-α mRNA及SP-A表达的影响

作　者: 李军
导　师: 吴旭
学　校: 南方医科大学
专　业: 胸心外科
关键词: 急性肺损伤蜕皮甾酮脂多糖肿瘤坏死因子-α 表面活性蛋白A
分类号: R563.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是指机体遭受严重创伤、休克、严重感染等打击后,出现肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞广泛损伤为病理特征的一种失控炎症反应；是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的早期阶段,临床上表现为进行性肺部弥漫性渗出致呼吸困难及难以纠正的低氧血症。目前ALI/ARDS发病机制复杂,尚未完全阐明,但经过大量基础研究表明氧化应激反应、炎性反应、内皮细胞功能紊乱等改变均参与疾病发展,其中炎症与抗炎症反应之间平衡与失衡在发病过程中起重要作用。目前,普遍认为ALI发病机制是在致病因子作用下激活中性粒细胞等多种炎性细胞,并释放大量炎性介质造成机体的损伤,同时这些炎性因子能作用其他炎性细胞来释放更多的炎性介质或细胞因子,使机体损害信号进一步放大,形成炎症瀑布效应,引起的过度或失控性的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)。在临床上,急性肺损伤的主要原因是细菌感染后释放内毒素引起的,致病主要成分是细菌细胞壁外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。LPS与相应受体结合后,启动细胞内信号转导系统,促进各种炎性细胞因子TNF-α等释放。这些炎性细胞和炎症介质相互作用,造成肺泡细胞、内皮细胞损伤,血管通透性增加,导致肺水肿,引起肺表面活性物质分泌减少,肺泡上皮屏障破坏。所以,本实验通过大鼠腹腔注射LPS复制ALI模型,并给予特定药物治疗,来观察炎性介质及抗炎物质水平的动态变化。肿瘤坏死因子α (Tumor Necrosis Factor α, TNF-α)在炎症中是一具始动和关键性作用的促炎免疫分子,主要由激活的中性粒细胞、单核/巨噬细胞、内皮细胞等细胞分泌,是具有多种功能的多肽。目前已知TNF-a与相应受体结合后,刺激炎性细胞粘附并释放氧自由基等大量炎性介质来发挥细胞毒性作用；刺激单核巨噬细胞增加IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等炎性因子的产生,进一步加重组织损伤。因此,TNF-α是观察ALI程度较好指标。表面活性蛋白(Surfactant Protein,SP)是主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞和细支气管非纤毛上皮细胞分泌的一类特异性脂蛋白复合物。SP含量中最丰富且生物活性最强的蛋白是肺表面活性蛋白A (Surfactant Protern A,SP-A).研究表明,它能维持肺泡的正常结构和功能；调节肺内免疫和炎症反应；参与调节肺表面活性物质的合成、代谢；通过特异性与微生物和微粒子结合,增强吞噬细胞的吞噬和杀菌能力,并抑制多种细胞因子和炎症介质的合成与释放。目前认为,SP-A在ALI患者中存在内源性代谢异常而减少,加重急性肺损伤。迄今,ALI/ARDS的药物治疗已成为临床研究的一个热点,但仍未找到切实可靠的治疗性药物,所以寻找其保护性药物十分必要。蜕皮甾酮(Ecdysterone, EDS)是一种广泛存在自然界的甾体化合物,属于昆虫生长代谢调节激素,最早为昆虫学家研究。现发现EDS在植物界也广泛存在且同样在高等动物表现出较强的生理活性：能促进核酸及蛋白质的合成、抗氧化、促进缺血区血管的生成和侧支循环的建立,还能有效促进伤口愈合等。近年来研究表明EDS还能改善肺组织水肿、降低肺血管通透性等作用,提示对ALI可能具有一定治疗作用。为了进一步探讨EDS对ALI治疗作用机理,我们通过脂多糖诱导ALI大鼠模型,观察EDS对ALI大鼠的肺组织中炎性介质TNF-α及SP-A的水平变化,以阐明EDS对ALI的治疗作用效果及可能的机制。目的观察不同剂量EDS对ALI大鼠肺组织中TNF-α mRNA及SP-A的表达的影响及其相关性；探讨蜕皮甾酮(EDS)对脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)的保护机理。方法1.实验动物模型制作与分组方法：通过Wister大鼠腹腔注射LPS建立急性肺损伤模型。120只健康SPF级成年雄性Wister大鼠,体重170-220克,随机分为模型组(24只,L组)、空白对照组(24只,N组)、治疗组(即不同剂量蜕皮甾酮组,T组)[分3个亚组：LPS+EDS20mg/kg组(T1组,24只)、LPS+EDS30mg/kg组(T2组,24只)、LPS+EDS40mg/kg组(T3组,24只)],各组根据注射脂多糖后观察时间不同再分为2h、4h、24h共3个亚组,每组8只。模型组和治疗大鼠均经腹腔注射脂多糖8mg/kg复制急性肺损伤模型,对照组腹腔注射等体积生理盐水。蜕皮甾酮不同剂量治疗组在建模1h后给予相应剂量的蜕皮甾酮溶液尾静脉注射；对照组及模型组给予相应等体积生理盐水。2.标本采集检测方法：分别于相应时间用3%戊巴比妥钠(30m/kg)腹腔麻醉各组后,腹主动脉放血处死动物。快速剪开胸腔,取出双侧肺脏。取各组大鼠右肺下叶HE染色观察病理改变,并根据病理学改变进行相应评分；取右上肺叶,计算各组肺湿重与肺干重比值(W/D)；并使用实时荧光定量PCR即(Real-time PCR, RT-PCR)法检测左肺组织匀浆TNF-α mRNA的表达；使用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定左肺组织匀浆中TNF-α;采用Western Blot方法检测SP-A的表达水平。结果1.一般状态观察：N组的大鼠呼吸平稳,未见紫绀,活动基本正常,反应灵敏；L组的大鼠在注射LPS后呼吸明显加快,活动不活跃,抓取时无力逃避,以4h最为明显并伴有紫绀；T组的大鼠呼吸急促程度较LPS组有所减轻,个别大鼠出现轻微紫绀,但较LPS组活泼,抓取时能够逃避。其中2h时,T组的状况相似,但在4h、24h时T3组较T1、T2组大鼠的状况较好。2.光镜下观察：200倍光镜下观察大鼠右下肺组织HE染色结果显示：N组大鼠肺组织的结构物完整,肺泡间隔无水肿,肺泡腔清晰,肺泡间质无炎性细胞浸润；L组肺泡壁破坏,腔内出血,肺间质充血水肿,有大量炎性细胞浸润；提示肺损伤模型成功。不同剂量T组的肺组织中相对于L组上述改变均有所减轻,程度随剂量增加而减轻。肺损伤的病理学评分依据肺泡和间质炎症及出血、肺水肿、肺不张和透明膜形成；经评分后进行统计学分析,各组间病理改变程度为L>T1>T2>T3>N;时间趋势为：各组肺损伤程度评分在时间上以4h为重,24h次之,2h较轻。3.肺干重／湿重(W/D)：与N组相比,L组及T组在2h,4h,24h各时间点W/D显着升高(P<0.05),其中4h为高峰,24h次之,2h最低。与L组相比,T组各亚组在4h,24h时间点W/D均显着降低(P<0.05),但在2h里,L组与T1、T2差异无统计学意义(P>0.05),而T3明显降低(P<0.05)。同一组内在不同时间上W/D的趋势为：4h>24h>2h。4.肺组织中TNF-α含量：N组TNF-α在各时相点表达均非常微弱,且相互之间无明显差别。其余各组与N组相比,表达均明显增强(P<0.05)。与LPS组比较,T组各亚组间在2h、4h、24h均可显著降低肺组织TNF-α的含量(P<0.05)。亚组之间比较：T3组在4h、24h时间点TNF-α的表达呈现T3<T2、T1(P<0.05),但在2h时与T2无明显差异；T2在2h、4h时间点TNF-α的表达显著低于T1(P<0.05),两者在24h无明显差异。在时间表达上,L组及各T亚组的组内在三个时间点的肺组织TNF-α的含量两两相比均有显著差异(P<0.05),呈现4h>2h>24h(P<0.05)。5.肺组织中TNF-α mRNA含量：实时荧光定量RT-PCR检测结果显示：N组TNF-α mRNA在各时相点的表达均非常微弱,且相互之间无明显差别。其余各组与N组相比,表达均明显增强(P<0.05)。与LPS组比较,T组在不同时间点均可显著降低肺组织TNF-α mRNA的表达(P<0.05)。T组亚组之间在2h、4h、24h时间点TNF-α mRNA的表达均呈现T3<T2<T1(P<0.05)。时间表达趋势为4小时最高,2小时次之,24小时最低,即4h>2h>24h(P<0.05)。6.肺组织中SP-A含量：在2h、4h、24h里,N组大鼠肺组织中SP-A表达无明显差异,但均明显高于比T组和L组(P<0.05)；T组各亚组之间在不同时间点的SP-A表达都高于L组,且有显著性差异(P<0.05)；T组亚组之间在24h时间点的肺组织SP-A表达随剂量增加而逐渐上升,即T3>T2>T1(P<0.05),在2h时,呈现T3>T2、T1(P<0.05),但T2、T1在此时间点相比无显著差异(P>0.05)。在4h时,呈现T3、T2>T1(P<0.05),但T2、T3在此时间点相比无显著差异(P>0.05)。时间表达趋势为4小时最低,24小时次之,2小时最高(P<0.05)。结论1.通过腹腔注射LPS可以成功复制ALI大鼠模型。2.LPS注射后导致大鼠肺组织水肿；光镜下肺损伤严重；促炎细胞因子TNF-α mRNA表达增强；肺保护物质SP-A含量下降。并在注射LPS4小时后,肺损伤程度最重,2h次之,24h时损伤有所减轻。3.蜕皮甾酮(EDS)对ALI具有保护作用,其效应具有浓度依赖性。其机制可能与抑制肺组织中TNF-α mRNA的表达,并促进SP-A合成及释放有关。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-17
前言  17-22
材料与方法  22-32
  1 实验材料及仪器  22-23
  2 实验方法  23-32
实验结果  32-44
  1 大鼠一般状态观察  32
  2 肺组织病理形态学变化  32-36
  3 大鼠肺组织湿重/干重(W/D)变化  36-38
  4 肺组织匀浆中ELISA法测TNF-α表达结果  38-40
  5 实验各组肺组织TNF-α mRNA的表达变化比较  40-41
  6 实验各组肺组织SP-A的表达变化比较  41-44
讨论  44-54
  1 LPS诱导的急性肺损伤动物模型的评价  44-47
  2 细胞因子TNF-α及SP-A在急性肺损伤中的作用  47-51
  3 蜕皮甾酮对肺损伤保护作用  51-54
结论  54-55
参考文献  55-60
符号说明  60-62
综述  62-72
  参考文献  68-72
成果  72-73
致谢  73-74

蜕皮甾酮对急性肺损伤大鼠肺组织中TNF-α mRNA及SP-A表达的影响

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