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还原响应型逐层组装纳米金非病毒给药载体的研究

作　者: 于菲菲
导　师: 钟延强
学　校: 第二军医大学
专　业: 药剂学
关键词: 基因治疗逐层自组装技术金纳米粒 pTAT多肽透明质酸靶向给药
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

基因治疗（gene therapy）的成功，在很大程度上依赖于基因传递载体，构建出有效的非病毒基因传递载体是近几十年科学家们研究探索的热点。纳米技术可以构建出毒性小且稳定性较好的被动靶向制剂，因此在各学科中具有广泛的应用前景。肝癌、肝炎等肝脏疾病均为当前需要重点研究的重大防治疾病。这个顽固堡垒没有被攻克的主要原因，除了治疗药物本身的药理作用尚不够理想外，就是没有将药物有效地递送至肝脏或肝脏的病变部位，即药物的肝靶向性差。本文采用层层自组装技术构建AuCM/pDNA/pTAT/HA基因纳米复合物非病毒给药载体，纳米复合物构建后体系为纳米级，可以通过RES系统获得被动靶向效果。体外细胞实验表明，载体系统具有高效低毒的特点，并能通过最外层的HA达到特异性的受体介导摄取效果，体内实验表明载体系统能够高效地携载pDNA主动靶向肝脏部位。为肝脏疾病的基因治疗提供实验基础和靶向研究策略。本文从三个部分来阐述该系统的构建以及基因递送效率：(1)功能化的金纳米的制备及表征；(2)谷胱甘肽响应型材料的制备及表征；(3)还原响应型逐层组装纳米金非病毒给药载体系统的构建及体内外实验。论文的第一部分，制备以及考察了不同修饰方法制备的三种不同的金纳米粒的性质及结构特点。首先，以PVP作为保护剂，柠檬酸钠为还原剂合成了普通纳米金（AuNPs）：DLS测得其粒径为10nm左右， Zeta电位为-19.7±4.1mV。由于该纳米金表面带负电荷，不能通过LbL手段直接吸附携载pDNA，而需要再在其表面进行修饰或吸附其它正电性材料，较为繁琐，并有可能在此过程中使稳定的纳米金变得更易聚集。其次，考察了脂质双分子层修饰的纳米金，以二甲基十八烷基溴化铵(DODAB)为材料合成DODAB-AuNPs，结果发现水化粒径较大（318.16±32.1nm），Zeta电位较高(70.83±2.3mV)，透射电镜下观察发现，除了脂质双分子层包被的金纳米粒，还有大量的金纳米粒被吸附到脂质纳米粒的表面，导致DLS测定的粒径较大，粒径分布不均。最后，制备了半胱胺修饰的金纳米粒（AuCM），动态光散射DLS测得其水化粒径为18±17.6nm，Zeta电势为+33.3±7.7mV，并通过透射电镜和原子力显微镜观察其形貌，粒子呈球形，粒径均一。AuCM的粒径，表面电势及形态特征等均能够满足逐层组装系统构建的需要。凝胶阻滞电泳结果显示：该AuCM与pDNA的质量比大于等于448：1时，pDNA能够被AuCM完全阻滞于上样孔中。此外，通过Hoechst33258荧光法测定得到其对基因的包封率在质量比为448：1时均大于90%，此结果与凝胶阻滞电泳结果相符。DNaseⅠ降解稳定性实验表明，当pDNA与AuCM形成复合物后，AuCM能够有效保护pDNA免被DNaseⅠ降解。除此之外，本部分还对三种功能化纳米粒的细胞毒性进行对比研究发现，PVP-AuNPs与AuCM细胞毒性远远低于DODAB-AuNPs，因此，采用半胱胺修饰的金纳米粒作为本课题研究的基因载体核心材料。第二部分，合成了两种含有新颖二硫键骨架结构的还原响应型材料SS-PEI和pTAT。首先，通过迈克尔加成合成SS-PEI，并用核磁对其进行表征，证明SS-PEI的成功合成。其次，采用固相合成法合成TAT多肽，液相色谱测定样品纯度，LC-MS测得TAT多肽的分子质量为Mw=1657.98，与理论值1659.00相符。进一步，通过在pH为8~9的条件下对TAT肽进行氧化，构建二硫键功能化的pTAT，用SEC法对其相对分子质量进行确定。以GTATG为对照，采用TNBs法建立pTAT的含量测定方法。最后，考察了pTAT与pDNA的结合能力以及进行了施加还原性物质DTT后的释放实验。凝胶电泳实验表明：当pTAT与pDNA的用量为3:2时，pTAT可以与pDNA有效地形成多肽-基因复合物，可将pDNA完全阻滞于上样孔内。还原响应实验表明：当加入20mM DTT后，pTAT材料的二硫键断裂，聚合物多肽形成小的短肽，有效的释放内部包裹的pDNA。该部分成功构建的还原响应释放的pTAT/pDNA复合物，为接下来实验部分的层层自主装响应性释药系统的构建提供了实验依据。第三部分，利用前面两部分的实验基础和优化条件，采用层层自组装的技术构建并表征AuCM/pDNA/pTAT/HA，并对其进行体外实验及体内分布进行考察。AuCM/pDNA/pTAT/HA纳米基因复合物的表征：随着pDNA，pTAT，HA层层组装，纳米基因复合物的颜色逐渐加深，DLS和AFM显示其粒径逐渐增大，Zeta电势呈正负交替变化，TEM下可观察到由pDNA，pTAT，HA组成的薄膜包被于AuCM的表面。体外细胞毒性试验表明，AuCM/pDNA/pTAT及AuCM/pDNA/pTAT/HA两种纳米复合物对COS-7和Hep G2细胞均无毒性。细胞内追踪定位实验显示，AuCM/pDNA/pTAT/HA纳米复合物载体，随着与HepG2细胞共孵育时间的增加分布于细胞膜，细胞质和细胞核周围，具有良好的细胞膜穿透能力以及有效定位于细胞核周围。TEM观察包覆不同层的复合物摄取结果显示，单独的AuCM易在Hep G2细胞内积聚，而AuCM/pDNA、AuCM/pDNA/pTAT在Hep G2细胞中均能较好的分散，而AuCM/pDNA/pTAT/HA更可在内涵体中均匀分散。体外HA竞争性抑制实验表明，AuCM/pDNA/pTAT/HA纳米复合物是经过HA-CD44特异性结合的方式进入细胞，即该系统具备受体介导的主动靶向功能。体外响应性试验，表明转染前细胞提前1h与20mM的GSH-OEt孵育后，能够获得更好的基因转染效率。转染实验表明，AuCM/pDNA/pTAT/HA荧光素酶报告基因的表达效率较LipofectamineTM2000和25kDa的bPEI更高。小鼠体内组织分布实验表明，AuCM，AuCM/pDNA、AuCM/pDNA/pTAT与AuCM/pDNA/pTAT/HA，均在肝脏中分布最多，在心和肾脏中分布最少。其中在肝脏的分布AuCM/pDNA/pTAT/HA组要明显高于AuCM/pDNA (p <0.001)，AuCM/pDNA/pTAT (p <0.01)组，表明AuCM/pDNA/pTAT/HA具备明显的肝靶向性。本研究针对解决目前非病毒载体面对的一系列困难，采用LbL为主要技术手段，以功能化的纳米级金粒子为核心，构建出多层自组装纳米级复合物载体。并且逐层组装吸附不同层材料，分别使其具有GSH触发智能释放、高效低毒、易于穿透细胞膜，有效逃逸内涵体并定位细胞核周围，呈现CD44介导的特异性内吞，以及体内肝靶向递送效果，对今后基因治疗中的非病毒给药载体的研究以及肝脏疾病方面的治疗具有重要意义。

还原响应型逐层组装纳米金非病毒给药载体的研究

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