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细胞因子IL－33与受体相互作用的结构生物学研究

作　者: 刘曦
导　师: 王新泉
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 白细胞介素33 X射线晶体学小角度X射线散射表面等离子共振
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

白细胞介素1（IL-1）是最早被发现和研究的细胞因子之一，对IL-1家族的研究已经有近40年的历史，目前为止，已发现的IL-1家族成员有11个，它们都在调节人体的先天免疫中起到了非常重要的作用。白细胞介素33（IL-33）是IL-1家族中的最新成员，拥有着调节人体先天性免疫和适应性免疫的多种功能。作为细胞因子的IL-33主要通过结合其特异性的受体ST2和共受体IL-1RAcP来向细胞内传递信号。ST2与IL-1RAcP都是IL-1受体家族的成员。IL-33作为配体介导的受体和共受体胞内TIR结构域的异源二聚化，可以有效地激活NF-kB与MAPK信号通路。IL-33不仅可以作为一种细胞因子对免疫系统进行调节，同时也可以作为一种转录调控因子参与到免疫反应当中。研究发现IL-33的成熟机制与其它IL-1家族成员有着很大的不同。这都使得IL-33在IL-1家族中的地位显得尤为特殊。IL-33与其受体的结构和功能研究都取得了一定的进展，但仍存在着很多需要解决的问题。IL-33与其受体的结构生物学研究不仅可以帮助我们了解IL-1家族识别受体的机制，也可以对治疗与IL-33相关的疾病起到帮助。本文通过解析分辨率为3.27的IL-33与ST2胞外域二元复合体的晶体结构，结合突变以及SPR等实验，揭示了ST2特异性识别IL-33的分子机制。同时通过小角度X射线散射（SAXS）的分析结果，验证了IL-33/ST2二元复合体招募IL-1RAcP所利用的机制是与已知的IL-1β/IL-1RII/IL-1RAcP以及IL-1β/IL-1RI/IL-1RAcP晶体结构所展示出相同的”左手”模型。SAXS的分析结果还显示ST2在溶液状态下比IL-1RAcP有着更大的柔性，二元复合体和三元复合体都拥有比较稳定的构象。根据上述的结果我们提出一个IL-1家族蛋白受体识别配体是利用结构域之间的构象变化的新机制，从而也解释了下游的信号通路必须有配体的存在才能被激活以及共受体IL-1RAcP不能单独识别配体的原因。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
主要符号对照表  10-11
第1章引言  11-29
  1.1 细胞因子  11-12
  1.2 白细胞介素-1（IL-1）家族  12
  1.3 IL-1 家族蛋白的发现  12-13
  1.4 IL-1 家族蛋白的成熟机制  13-14
  1.5 IL-1 家族蛋白的受体  14-17
  1.6 IL-1 家族蛋白结构的研究现状  17-19
  1.7 IL-1 家族蛋白与疾病  19-21
  1.8 IL-1 家族中的特殊成员－IL-33  21-26
  1.9 IL-33 的结构生物学研究现状  26
  1.10 本文的研究目的、技术路线与研究意义  26-29
第2章材料与方法  29-61
  2.1 引言  29
  2.2 实验材料  29-37
    2.2.1 相关基因的获取  29
    2.2.2 克隆与表达载体  29-31
    2.2.3 菌种与细胞株  31-32
    2.2.4 细胞系  32
    2.2.5 克隆构建  32-33
    2.2.6 试剂  33-34
    2.2.7 耗材与仪器  34-35
    2.2.8 常用缓冲溶液及培养基  35-37
  2.3 实验方法  37-61
    2.3.1 表达载体的构建  37-40
      2.3.1.1 引物设计  37
      2.3.1.2 PCR 扩增目的片段  37-38
      2.3.1.3 目的片段的回收、酶切与连接  38
      2.3.1.4 感受态细胞的制备  38-39
      2.3.1.5 连接产物或质粒的转化  39
      2.3.1.6 阳性克隆和重组子的筛选  39
      2.3.1.7 突变体的构建  39-40
    2.3.2 蛋白的表达与纯化  40-46
      2.3.2.1 大肠杆菌对重组蛋白的小量表达与检测  40
      2.3.2.2 大肠杆菌表达重组蛋白的大量提取  40
      2.3.2.3 大肠杆菌表达硒代重组蛋白的大量提取  40-41
      2.3.2.4 昆虫细胞的培养  41
      2.3.2.5 转染昆虫细胞获得表达目的蛋白的病毒  41-42
      2.3.2.6 昆虫细胞表达目的蛋白的小量检测  42
      2.3.2.7 昆虫细胞表达目的蛋白的大量提取  42-43
      2.3.2.8 亲和柱层析纯化  43-44
      2.3.2.9 离子交换柱层析纯化  44
      2.3.2.10 分子筛层析纯化  44-45
      2.3.2.11 重组蛋白的去糖基化处理  45-46
    2.3.3 蛋白质的结晶  46-48
      2.3.3.1 蛋白质结晶的原理  46-48
      2.3.3.2 晶体的初筛  48
      2.3.3.3 晶体的优化  48
    2.3.4 蛋白质晶体的 X 射线衍射  48-53
      2.3.4.1 晶体 X 射线衍射的原理  48-50
      2.3.4.2 衍射数据的收集  50-51
      2.3.4.3 数据的处理与结构的解析  51-53
      2.3.4.4 结构的修正  53
      2.3.4.5 常用的蛋白晶体学软件  53
    2.3.5 蛋白质溶液状态下的 X 射线小角度散射  53-56
      2.3.5.1 X 射线小角度散射原理  53-54
      2.3.5.2 散射数据的收集  54-55
      2.3.5.3 数据的处理及模型的建立  55-56
      2.3.5.4 常用的工具软件  56
    2.3.6 表面等离子共振（SPR）  56-58
      2.3.6.1 SPR 的原理  56
      2.3.6.2 SPR 检测蛋白质-蛋白质之间相互作用  56-58
    2.3.7 荧光素酶报告基因实验（Luciferase assay）  58-61
第3章重组蛋白的表达纯化与制备  61-74
  3.1 引言  61
  3.2 蛋白的基本信息  61-62
  3.3 IL-33 蛋白的表达与纯化  62-65
    3.3.1 野生型 IL-33 的表达与纯化  62-65
    3.3.2 IL-33 突变体的表达与纯化  65
  3.4 受体 ST2 与 IL-1RAcP 胞外域的表达与纯化  65-68
    3.4.1 野生型受体的纯化  65-66
    3.4.2 二元复合体与三元复合体的体外重组与纯化  66-68
  3.5 蛋白的去糖基化处理  68-73
    3.5.1 糖基化位点突变蛋白的表达  68-69
    3.5.2 糖苷酶处理蛋白  69-73
  3.6 小结  73-74
第4章 IL-33 与 ST2 二元复合体 X 射线晶体学研究  74-88
  4.1 引言  74
  4.2 结果与讨论  74-87
    4.2.1 结晶条件的筛选  74-80
    4.2.2 结构的解析  80-87
      4.2.2.1 数据的准备  80
      4.2.2.2 分子置换法求解相位  80
      4.2.2.3 反常散射法求解相位  80-84
      4.2.2.4 模型搭建  84-85
      4.2.2.5 结构的修正  85-87
  4.3 小结  87-88
第5章 IL-33 与受体 ST2 二元复合体的结构分析  88-94
  5.1 引言  88
  5.2 结果与讨论  88-93
  5.3 小结  93-94
第6章 IL-33 与受体复合物的 X 射线小角度散射（SAXS）的研究  94-104
  6.1 引言  94
  6.2 结果与讨论  94-103
    6.2.1 数据处理  94-96
    6.2.2 模型的建立和检验  96-103
  6.3 小结  103-104
第7章 IL-33 与受体相互作用的生化分析  104-110
  7.1 引言  104
  7.2 结果与讨论  104-109
    7.2.1 SPR 检测 IL-33 及其突变体与 ST2 的结合  104-106
    7.2.2 SPR 检测 IL-33 区域突变体对三元复合体形成的影响  106-108
    7.2.3 荧光素酶报告基因实验研究 IL-33 突变对激活 NF-κB 的影响  108-109
  7.3 小结  109-110
第8章博士期间其它研究工作  110-123
  8.1 细胞内的氧化还原调节  110-111
  8.2 AtGrxS16 蛋白  111
  8.3 AtGrxS16 N 端结构域具有 GIY-YIG 核酸酶的分子结构特点  111-112
  8.4 AtGrxS16 N 端结构域酶活中心与 GIY-YIG 核酸酶的比对  112-115
  8.5 在酵母中 AtGrxS16 N 端结构域抑制 C 端的 Grx 活性  115
  8.6 AtGrx S16 蛋白具有高聚体，二聚体和单体的形式  115-116
  8.7 AtGrx S16 蛋白二聚体形式含有 Fe-S 中心  116-117
  8.8 AtGrxS16 N 端结构域的核酸酶活性测定  117
  8.9 AtGrxS16 N 端结构域突变体的核酸酶活性测定  117-118
  8.10 不同的二价阳离子对于重组 AtGrxS16 N 端结构域核酸酶活性的影响  118-119
  8.11 AtGrxS16 N 端结构域对 cpDNA 的核酸酶活性测定  119-120
  8.12 AtGrxS16 全长蛋白中形成链内二硫键  120-121
  8.13 AtGrxS16 蛋白中的链内二硫键同时调节 N 端以及 C 端的活性  121
  8.14 AtGrxS16 在叶绿体中行使功能的模型  121-123
第9章总结与展望  123-128
  9.1 工作总结  123-126
  9.2 工作展望  126-128
参考文献  128-134
致谢  134-136
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  136

细胞因子IL－33与受体相互作用的结构生物学研究

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