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抗肿瘤DNA疫苗研究以及抗原抗体复合物抗原在树突状细胞中加工递呈的研究

作　者: 刘虎
导　师: 王宾
学　校: 中国农业大学
专　业: 微生物学
关键词: p42.3 DNA疫苗肿瘤树突状细胞免疫复合物抗原交叉递呈 HBV
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

DNA疫苗能够同时诱导产生体液免疫反应和细胞免疫反应,而且与传统疫苗相比,在设计、制备和安全性等方面具有诸多优势,这促使DNA疫苗平台逐渐成为疫苗研究开发的热点。树突状细胞是专职抗原加工递呈细胞,在疫苗诱导机体产生先天免疫反应和适应性免疫反应中起着至关重要的作用。本研究的主要目的是采用DNA疫苗技术研究开发用于抗肿瘤的DNA疫苗并且对树突状细胞对抗原加工递呈的机理进行初步探讨。P42.3基因具有肿瘤特异性与分裂周期密切相关,并且发现其在多种肿瘤中表达。这些发现预示p42.3抗原可以作为肿瘤靶标用于疫苗的研制。在本研究中,我们采用体内穿孔仪电击免疫方式将编码p42.3抗原的DNA疫苗分别免疫接种给C57BL/6小鼠,并且利用B16F10黑色素瘤细胞给免疫前或免疫后的小鼠进行攻击,评价p42.3DNA疫苗对小鼠黑色素瘤的预防和治疗效果。实验结果表明,p42.3DNA疫苗能够在小鼠体内诱导产生高水平针对p42.3抗原的特异性细胞杀伤和分泌IFN-γ、perforin和granzyme B的CD8+T细胞。通过评价肿瘤的生长速度和肿瘤的重量,结果表明p42.3DNA疫苗在小鼠黑色素瘤预防和治疗模型中都能诱导一定的抗肿瘤效果。因此,本研究首次证明采用针对新肿瘤靶标p42.3的DNA疫苗可能是一个具有潜在价值的抗肿瘤治疗手段。HBV感染引起的疾病在全球都有广泛分布并且严重影响人类健康。尽管HBV预防性疫苗在很大程度上降低了HBV的感染,但是对HBV感染的治疗仍然是一个严重的全球问题。前期闻玉梅院士进行了一系列的临床实验研究,这些临床实验结果表明免疫酵母表达的HBsAg和抗HBsAg免疫球蛋白(HBIG)形成的复合物(YIC)能够在部分慢性乙肝病人中降低HBV病毒载量并且诱导产生抗HBeAg的抗体。在本研究中,我们深入分析了HBsAg和HBIG形成的免疫复合物在树突状细胞中的摄入和加工递呈过程,结果表明HBsAg和HBIG免疫复合物的摄入是通过树突状细胞上的Fcr受体介导并且以这种方式摄入的抗原能够发生较多的交叉递呈,并且免疫复合物处理的树突状细胞能够在小鼠体内诱导产生更强的T细胞反应。这些结果丰富了关于抗原抗体免疫复合物在抗原递呈细胞中的加工和递呈研究并且为我们进一步优化这种治疗性乙肝疫苗提供了理论基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
目录  7-9
縮略词表  9-10
实验主要仪器  10-11
图表清单  11-12
第一章引言  12-38
  1.1 肿瘤特征及其免疫调控和治疗  12-21
    1.1.1 肿瘤的特征  12-15
    1.1.2 肿瘤免疫调控  15-17
    1.1.3 肿瘤免疫治疗  17-19
    1.1.4 结语  19-21
  1.2 DNA疫苗及其在肿瘤中的临床研究  21-32
    1.2.1 DNA疫苗制备和免疫流程  21-22
    1.2.2 DNA疫苗作用机理  22-23
    1.2.3 DNA疫苗的优缺点  23-24
    1.2.4 DNA疫苗增强策略  24-28
    1.2.5 肿瘤DNA疫苗的临床研究  28-31
    1.2.6 结语  31-32
  1.3 树突状细胞抗原加工递呈  32-38
    1.3.1 DC的发现和分型  32
    1.3.2 DC对外来抗原加工递呈途径  32-33
    1.3.3 MHC和抗原递呈  33-35
    1.3.4 抗原交叉递呈机制和模型  35-36
    1.3.5 免疫复合物调控理论  36-37
    1.3.6 结语  37-38
第二章材料与方法  38-43
  2.1 实验动物,细胞及试剂  38
  2.2 质粒DNA大量制备  38-39
  2.3 重组质粒转染NIH-3T3细胞  39
  2.4 Western Blot  39
  2.5 实验动物分组及免疫  39
  2.6 P42.3蛋白原核表达和纯化  39
  2.7 ELISA法检测血清特异性抗体水平  39-40
  2.8 小鼠黑色素瘤模型  40
  2.9 体内CTL水平检测  40
  2.10 流式细胞术检测细胞因子的表达水平  40-41
  2.11 免疫荧光  41
  2.12 活细胞成像  41
  2.13 DC2.4体外孵育和过继转移  41-42
  2.14 统计学分析  42-43
第三章 P42.3 DNA疫苗在小鼠黑色素瘤模型中抗肿瘤效果研究  43-54
  3.1 引言  43-44
  3.2 结果  44-52
    3.2.1 重组质粒在真核细胞中的表达以及小鼠黑色素瘤细胞系B16F10中p42.3的表达  44-45
    3.2.2 P42.3蛋白原核表达纯化和鉴定  45
    3.2.3 P42.3 DNA疫苗能够在小鼠体内诱导产生抗原特异性IgG抗体  45-46
    3.2.4 免疫p42.3 DNA疫苗能够抑制皮下B16F10黑色素瘤的生长  46-48
    3.2.5 免疫p42.3 DNA疫苗能够抑制B16F10的实验性肺部转移  48
    3.2.6 免疫p42.3 DNA疫苗能够在一定程度上治疗皮下B16F10黑色素瘤  48-50
    3.2.7 CD8+T细胞在p42.3 DNA疫苗诱导的抗肿瘤中起着重要的作用  50
    3.2.8 免疫p42.3 DNA疫苗能够在小鼠体内诱导产生高水平CTL  50-51
    3.2.9 免疫p42.3 DNA疫苗能够在小鼠体内激活CD8+T细胞  51-52
  3.3 讨论  52-53
  3.4 小结  53-54
第四章免疫复合物在树突状细胞中的加工和递呈研究  54-66
  4.1 引言  54-55
  4.2 结果  55-64
    4.2.1 IC易被THP-1分化的巨噬细胞摄取并且IC主要分布在胞内酸性细胞器中  55-56
    4.2.2 DC2.4细胞对IC的摄入是部分依赖于Fcγ受体  56-57
    4.2.3 IC能够与早期内体、晚期内体和溶酶体共定位,但与高尔基体不能共定位  57-58
    4.2.4 IC在早期内体、晚期内体和溶酶体中发生部分分离  58-60
    4.2.5 IC能够与分布于内体、溶酶体和内质网上的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子共定位  60-62
    4.2.6 孵育IC的DC2.4细胞能够在小鼠体内有效的激活T细胞  62-64
  4.3 讨论  64-65
  4.4 小结  65-66
第五章结论与展望  66
本研究的创新点  66-67
参考文献  67-87
致谢  87-88
附录  88-93
  附录1：常用试剂配方  88-90
  附录2：pcDNA3载体质粒图谱  90-91
  附录3：pET28a(+)载体质粒图谱  91-92
  附录4：P42.3 基因序列  92-93
个人简介  93-94
博士期间已发表和待发表文章  94

抗肿瘤DNA疫苗研究以及抗原抗体复合物抗原在树突状细胞中加工递呈的研究

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