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乙酰胆碱在前庭传出神经系统外周的作用机制及酶对其受体介导电流的影响

作　者: 周涛
导　师: 孔维佳
学　校: 华中科技大学
专　业: 耳鼻咽喉科学
关键词: 钙离子激活的钾通道毒蕈碱型胆碱能受体 G蛋白腺苷酸环化酶环磷酸腺苷烟碱型胆碱能受体前庭毛细胞大电导钙离子激活的钾通道小电导钙离子激活的钾通道 Scarpa神经节神经盏乙酰胆碱
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

第一部分M2型胆碱能受体介导的BK电流在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞内的信号转导机制目的：大量的研究证实乙酰胆碱(ACh)是前庭外周传出系统的主要抑制性传出神经递质。我们最新研究发现,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到的ACh激活的大电导钙激活钾通道是通过m2型胆碱能受体介导。m2型胆碱能受体属于代谢型受体,其在Ⅱ型前庭毛细胞内的信号转导机制尚不清楚。方法：取健康成年豚鼠,麻醉后取出耳蜗,分离出前庭外周终器(球囊、椭圆囊、壶腹),酶消化后,分离出活性良好的前庭毛细胞,置入涂有鼠尾胶原的培养皿中贴壁,在倒置显微镜下选取Ⅱ型前庭毛细胞行全细胞膜片钳研究。结果：1)细胞内应用100μM/L的GTPyS(一种不能被水解的GTP类似物)引起一持续的外向电流,1-2分钟内电流达到最大(225.8±42.6pA,n=4)；2)细胞外给予10μM/L的GAPnt-2(一种Gi蛋白的a亚单位抑制剂)孵育1分钟,对ACh引起的电流没有影响(ACh,117.6±21.5pA, GAPnt-2+ACh111.6±19.3pA, p=0.14, n=5);然而,细胞外给予Gi蛋白α亚单位和βγ亚单位抑制剂400ng/ml的PTX,4分钟内最大抑制作用为85.3±6.6%(n=5);3)1mM db-cAMP(一种cAMP的类似物)与100μM/L的ACh一起作用于豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞,电流幅度增加了1.3倍(n=5)。然后,给予腺苷酸环化酶抑制剂100μM/L的2,5-dd-Ado1分钟,最大抑制效应是65.9±8.8%(n=5),这时需要孵育3分钟外液才能完全恢复(n6)。结论：通过本研究,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上乙酰胆碱激活的大电导钙激活钾通道是通过m2型胆碱能受体介导的Gi蛋白的βγ亚单位转导,从而影响AC的活性,进一步引起细胞内cAMP的升高,,进一步导致钙通道的磷酸化,钙离子内流,从而激活BK电流。第二部分M2型和α9型胆碱能受体介导的两种不同通道在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上共存目的：分子生物学研究证实乙酰胆碱(ACh)是前庭外周传出系统的主要抑制性传出神经递质。目前认为哺乳动物前庭外周传出神经递质ACh释放作用于Ⅱ型前庭毛细胞上,引起离子型的胆碱能受体α9介导的通道打开,进一步引起钙离子内流,从而激活小电导钙激活的钾离子通道(SK2)开放。然而我们最新研究发现,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到ACh作用于M2型胆碱能受体,从而激活细胞内信号转导通路,进一步激活大电导钙激活的钾离子通道(BK)开放。根据以上两种结果的差异性,在本次研究中我们进一步研究这两种不同受体介导的不同通道(SK2和BK)在同一个细胞上的关系。方法：取健康成年豚鼠,麻醉后取出耳蜗,分离出前庭外周终器(球囊、椭圆囊、壶腹),酶消化后,分离出活性良好的前庭毛细胞,置入涂有鼠尾胶原的培养皿中贴壁,在倒置显微镜下选取Ⅱ型前庭毛细胞行全细胞膜片钳研究。结果：1)在胶原酶IA消化的Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到M2型胆碱能受体介导的BK电流；2)在胰酶消化的Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到α9型胆碱能受体激活的SK2电流；3)首先在胰酶消化的毛细胞上我们记录到了α9型胆碱能受体激活的SK2电流,这种电流能被a9型胆碱能受体特异性抑制剂蜂毒明肽(apamin)抑制,而不能被M2型胆碱能受体抑制剂美索曲明(methoctramine)抑制。然后我们对这个在记录状态下的细胞用胶原酶IA进行消化3分钟。用正常外液孵育5分钟后,再次给予ACh,引起一缓慢激活的不失活的外向电流,这种电流不能被α9型胆碱能受体特异性抑制剂蜂毒明肽(apamin)抑制,而能被M2型胆碱能受体抑制剂美索曲明(methoctramine)抑制。结论：本研究发现M2和a9型胆碱能受体在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上共存,同时BK和SK2通道也共存于同一个细胞上。但是两种不同受体介导的不同通道的激活需要的消化酶不同,从而揭示酶可能对通道具有消化作用。第三部分大电导钙激活的钾通道(BK)和小电导钙激活钾通道(SK2)在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上的分布目的：大量的研究证实乙酰胆碱(ACh)是前庭外周传出系统的主要抑制性神经递质。目前认为哺乳动物前庭外周传出神经递质ACh释放作用于Ⅱ型前庭毛细胞上,引起离子型的胆碱能受体α9介导的通道打开,进一步引起钙离子内流,从而激活小电导钙激活的钾离子通道(SK2)开放。并且我们最新研究发现,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到ACh通过m2型胆碱能受体激活大电导钙激活钾离子通道(BK)。然而,BK和SK2通道在哺乳动物前庭外周感觉上皮和Scarpa神经节上的分布尚不清楚。方法：采用正常成年大鼠,取内耳行冰冻切片,进行免疫荧光染色,检测BK和SK2在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上的表达。结果：BK和SK2通道在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上均有表达。1)BK通道选择性的表达于部分Ⅰ型和部分Ⅱ型前庭毛细胞上,而SK2通道表达于所有的Ⅰ型和Ⅱ型前庭毛细胞上；2)SK2通道表达于前庭支持细胞上,而BK通道不表达于支持细胞上；3)SK2通道表达于传入神经末梢上,而BK通道不表达；4)BK和SK2通道都表达于三种类型的Scarpa神经节胞体上。结论：BK和SK2通道在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上均有表达。表明BK和SK2通道不仅在传出神经递质ACh释放调节Ⅱ型前庭毛细胞中起作用,在维持Ⅰ型前庭毛细胞的兴奋性中也可能起重要的作用。同时SK2通道的激活在前庭平衡感觉传入中也起到了重要的调节,但是BK通道不参入这个过程。在Scarpa神经节上BK和SK2通道可能参与了细胞动作电位产生从而调节细胞的兴奋性。

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英文缩略词表  7-9
中文摘要  9-13
ABSTRACT  13-18
第一部分 M2型胆碱能受体介导的BK电流在Ⅱ型前庭毛细胞内的信号转导机制  18-35
  前言  18-20
  材料和方法  20-22
  结果  22-25
  讨论  25-27
  参考文献  27-32
  附实验结果图解  32-35
第二部分 M2型和α9型胆碱能受体介导的两种不同通道在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上共存  35-58
  前言  35-38
  材料和方法  38-40
  结果  40-43
  讨论  43-48
  结论  48-49
  参考文献  49-54
  附实验结果图解  54-58
第三部分大电导钙激活的钾通道(BK)和小电导钙激活钾通道(SK2)在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上的分布  58-88
  前言  58-60
  材料与方法  60-63
  结果  63-67
  讨论  67-70
  参考文献  70-78
  附实验结果图解  78-88
综述_内耳传出神经系统释放的神经递质作用及机体调节递质释放机制的研究新进展  88-113
  参考文献  99-113
附录  113-114
致谢  114-115

乙酰胆碱在前庭传出神经系统外周的作用机制及酶对其受体介导电流的影响

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