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重组梅花鹿胸腺素β₄原核表达载体的构建及活性研究

作　者: 李晓华
导　师: 曲晓波
学　校: 长春中医药大学
专　业: 药理学
关键词: 鹿茸 Tβ4 克隆原核表达活性
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：运用基因工程技术构建梅花鹿胸腺素β4(Thymosin β4, Tβ4)原核表达载体,并诱导其表达目的蛋白,对纯化的目的蛋白进行细胞活性研究,为揭示Tβ4在鹿茸中高表达的生物学意义以及开发应用奠定基础。方法：采用Trizol法提取鹿茸总RNA；采用RT-PCR法扩增Tβ4目的基因；进行TA克隆、基因测序以及构建原核表达载体pET-28a-Tβ4;将表达载体转化到E.coli BL21宿主菌中,用IPTG诱导表达目的蛋白；运用金属螯合层析技术和凝胶层析技术纯化目的蛋白；利用Bradford法测定蛋白含量；采用MTT法进行成骨细胞和软骨细胞活性实验研究。结果：1、成功扩增出Tβ4目的基因,全长为135bp,编码45个氨基酸,PI为5.02,理论分子量为5052.65。2、构建了pET-28a-Tβ4原核表达载体；经优化得到最佳IPTG诱导浓度和诱导时间分别为0.5mM、4h。3、目的蛋白经亲和层析和凝胶层析纯化后,SDS-PAGE电泳结果显示为单一条带,且分子量大小与理论值相吻合；蛋白纯度为91.6%。4、细胞活性研究表明,重组胸腺素β4对成骨细胞和软骨细胞均有明显的增殖作用。结论：Tβ4具有明显的促进骨细胞增殖活性,在鹿茸的快速生长过程应发挥较为重要的作用,重组Tβ4可为开发高科技含量的梅花鹿产品奠定基础。

全文目录

中文摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
英文缩写词表  9-11
前言  11-12
文献综述  12-16
  1 胸腺素β_4研究进展  12-14
    1.1 化学结构  12
    1.2 生物学分布  12-13
    1.3 药理作用  13-14
    1.4 临床研究进展  14
  2 多肽的纯化研究  14-15
  3 本研究的内容及意义  15-16
实验研究  16-46
  1 材料与仪器  16-21
    1.1 材料  16
    1.2 试剂与配制  16-20
    1.3 仪器  20-21
  2 技术路线  21-22
  3 实验方法  22-34
    3.1 引物设计  22
    3.2 提取鹿茸总RNA  22-23
    3.3 Tβ_4基因的RT-PCR扩增  23-24
    3.4 琼脂糖凝胶电泳  24
    3.5 目的基因的PCR产物回收  24-25
    3.6 TA克隆  25
    3.7 制备E.coli DH5α感受态细胞  25
    3.8 pMD~(TM)18-T-Tβ_4的转化  25-26
    3.9 EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切鉴定  26
    3.10 质粒pMD~(TM)18-T-Tβ_4的测序  26-27
    3.11 表达载体的构建  27-28
    3.12 IPTG诱导表达  28-29
    3.13 粗蛋白液制备  29-30
    3.14 蛋白纯化  30-32
    3.15 蛋白含量测定——Bradford法  32
    3.16 活性检测——MTT法  32-34
  4 实验结果  34-46
    4.1 鹿茸总RNA的提取  34
    4.2 Tβ_4基因的扩增  34-35
    4.3 TA克隆及测序鉴定结果  35
    4.4 Tβ_4测序结果  35-37
    4.5 表达载体构建及测序结果  37-38
    4.6 Tβ_4蛋白表达  38-40
    4.7 Tβ_4蛋白的纯化  40-42
    4.8 蛋白含量测定  42-43
    4.9 Tβ_4蛋白细胞活性检测  43-46
讨论  46-49
  1 RNA的提取  46
  2 表达载体的成功构建  46
  3 蛋白表达及纯化  46-47
  4 细胞活性研究  47-49
结语  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-58
已发表文章  58

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