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黄药子中性多糖的结构分析及其抗肿瘤活性研究

作　者: 刘晓宇
导　师: 台桂花
学　校: 东北师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黄药子 多糖 结构分析 化学修饰 抗肿瘤活性
分类号: R284.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


黄药子（Rhizoma Dioscorea Bulbiferac），是薯蓣科植物黄独（Dioscorea bulbifera L.）的块茎，作为中药在我国已有2000多年的历史，在中药处方中用于治疗咽喉肿痛、癌肿、咳血、疮疡肿毒等。多糖是黄药子的重要活性成分，已有文献报道黄药子多糖具有调节免疫、抗肿瘤等活性，但有关黄药子多糖的结构研究还未见报道，缺乏对黄药子多糖的全面系统的认识。本论文对黄药子多糖进行分级纯化，明确了黄药子中性多糖的组成及结构，并从中获得主要成分进行硫酸化和羧甲基化修饰，再通过对肿瘤细胞增殖和半乳凝素-3抑制活性的测定，比较多糖在修饰前后的抗癌活性，从而为黄药子多糖的进一步研究与开发提供理论基础。本论文通过热水煮提和乙醇沉淀得到黄药子水溶性总多糖DBP，将DBP用DEAE-纤维素柱层析进行分级纯化。分别利用浓度为0、0.1、0.3和0.5M的氯化钠水溶液进行分步洗脱，得到相应的四个级分：中性级分DBPN和三个酸性级分DBPA-1、DBPA-2和DBPA-3。通过酶学方法、凝胶渗透色谱和高效液相色谱法分析黄药子多糖各级分的基本结构特征：中性糖DBPN主要由半乳聚糖和葡聚糖组成；DBPA-1含有同聚半乳糖醛酸（homogalacturonan，HG）和半乳聚糖结构；DBPA-2含有HG结构，并可能含有少量I型聚鼠李半乳糖醛酸（rhamnogalacturonan I，RG-I）结构；DBPA-3以典型的HG结构为主。利用分级醇沉法，将DBPN进一步分级纯化得到分子量均一的6个级分DBPN-1~DBPN-6，重均分子量依次为22.4、1.0、0.73、0.54、0.36和0.26kDa，这6个级分主要由半乳糖和葡萄糖构成。通过对六个级分酶解特征的分析验证了黄药子中性多糖中存在独立的半乳聚糖和葡聚糖。应用高碘酸氧化、Smith降解、甲基化、傅立叶红外光谱和核磁共振等方法确定了半乳聚糖的结构为没有分支的线性β-1,4-半乳聚糖（DBPN-UD），葡聚糖为以α-1,4-Glcp为主链，并存在少量6位分支的淀粉样多糖。线性β-1,4-半乳聚糖是DBPN的主要成分，这是首次从黄药子中提取得到天然的β-1,4-半乳聚糖。因为β-1,4-半乳聚糖在黄药子中性多糖中含量高并且制备方法简单，所以黄药子是制备β-1,4-半乳聚糖的优良选材。以DBPN-UD为底物，利用三氧化硫-吡啶法制备得到6个不同取代度的硫酸化半乳聚糖， S-DBPN-UD-0.1、 S-DBPN-UD-0.25、 S-DBPN-UD-0.5、 S-DBPN-UD-1、 S-DBPN-UD-2和S-DBPN-UD-4，取代度分别为0.12、0.26、0.63、1.42、0.92和1.02；采用氢氧化钠-氯乙酸反应体系，以异丙醇为溶剂，制备得到6个不同取代度的羧甲基化半乳聚糖， CM-DBPN-UD-0.1、 CM-DBPN-UD-0.25、 CM-DBPN-UD-0.5、 CM-DBPN-UD-1、C M-DBPN-UD-2和CM-DBPN-UD-3，取代度分别为0.16、0.21、0.26、0.46、0.62和0.70。最后我们利用肿瘤细胞增殖和半乳凝素-3抑制实验比较了修饰前后多糖的抗肿瘤活性。抑制肿瘤细胞增殖实验中，我们以小鼠肉瘤细胞S180和两种人结肠癌细胞株HCT-116和HT-29为实验对象，测定了DBPN及其衍生物的活性，结果表明，硫酸化和羧甲基化修饰可以增强DBPN-UD对肿瘤细胞增殖的抑制活性，抑制活性具有浓度依赖性，并随取代度的增大而增强。对半乳凝素-3的抑制实验结果表明，DBPN-UD具有很好的抑制活性，在12.5mg/mL时可以完全抑制由半乳凝素-3引起的红细胞凝集，因此DBPN-UD具有很好的开发为半乳凝素-3抑制剂的潜力。但硫酸化和羧甲基化修饰会降低DBPN-UD对半乳凝素-3的抑制活性。本论文的研究结果为黄药子多糖的进一步研究与开发提供了理论基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
中英文对照及英文缩写词表  8-13
第一章 前言  13-35
  1 多糖的研究进展  13-19
    1.1 多糖的结构  13-15
    1.2 中药多糖的生物活性  15-17
    1.3 中药多糖的构效关系  17-19
  2 多糖的化学修饰  19-22
    2.1 多糖的硫酸化  19
    2.2 多糖的羧甲基化  19-20
    2.3 多糖的乙酰化  20-21
    2.4 多糖的磷酸酯化  21
    2.5 多糖的烷基化  21
    2.6 多糖的其它修饰  21-22
  3 黄药子的研究概述  22-27
    3.1 黄药子的药理及临床应用  22-23
    3.2 黄药子化学成分的研究进展  23-27
  4 选题依据、目的和意义  27-28
  5 课题研究内容  28-29
  参考文献  29-35
第二章 黄药子多糖的提取  35-44
  1 材料  35-36
    1.1 原料  35
    1.2 试剂  35-36
    1.3 仪器  36
    1.4 凝胶及层析柱  36
  2 实验方法  36-39
    2.1 黄药子水溶性总糖 DBP 的提取  36-37
    2.2 总糖含量的测定  37
    2.3 糖醛酸含量的测定  37-38
    2.4 淀粉含量的测定  38
    2.5 单糖组成分析  38-39
    2.6 多糖的分子量和均一性测定  39
  3 结果  39-42
    3.1 黄药子水溶性多糖的提取  39-41
    3.2 黄药子水溶性多糖分子均一性测定  41-42
  4 讨论  42
  5 小结  42-43
  参考文献  43-44
第三章 黄药子多糖的分级  44-54
  1 材料  44-45
    1.1 试剂  44
    1.2 仪器  44-45
    1.3 凝胶和层析柱  45
  2 方法  45-46
    2.1 黄药子多糖的离子交换柱层析  45-46
    2.2 黄药子多糖各级分的凝胶柱层析  46
    2.3 淀粉含量测定  46
    2.4 单糖组成分析  46
  3 结果  46-49
    3.1 黄药子多糖的离子交换柱层析  46-48
    3.2 黄药子多糖各级分的凝胶柱层析  48-49
    3.3 各级分糖含量、淀粉含量及单糖组成分析  49
  4 讨论  49-51
    4.1 多糖的 DEAE-纤维素柱层析分级  49-50
    4.2 黄药子多糖各级分结构特征分析  50-51
  5 小结  51-52
  参考文献  52-54
第四章 黄药子中性多糖的精细结构研究  54-77
  1 材料  54-55
    1.1 试剂  54-55
    1.2 仪器  55
    1.3 凝胶和层析柱  55
  2 方法  55-59
    2.1 DBPN 的凝胶柱层析分析  55
    2.2 DBPN 的分级醇沉  55-56
    2.3 高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测多糖的分子量和均一性  56
    2.4 酶解  56
    2.5 高碘酸氧化和 Smith 降解  56-58
    2.6 甲基化分析  58-59
    2.7 FT-IR 分析  59
    2.8 NMR 分析  59
  3 结果  59-72
    3.1 DBPN 的分级纯化  59-63
    3.2 DBPN 的精细结构研究  63-72
  4 讨论  72-74
    4.1 DBPN-UD 的结构分析  72
    4.2 黄药子中性多糖的精细结构分析  72-73
    4.3 黄药子中天然半乳聚糖的存在意义  73-74
  5 小结  74-75
  参考文献  75-77
第五章 DBPN-UD的结构修饰  77-95
  1 材料  77-78
    1.1 试剂  77
    1.2 仪器  77-78
    1.3 凝胶及层析柱  78
  2 方法  78-80
    2.1 DBPN-UD 的制备  78
    2.2 DBPN-UD 的硫酸化修饰  78-79
    2.3 DBPN-UD 的羧甲基化修饰  79-80
  3 结果  80-89
    3.1 DBPN-UD 的制备  80-81
    3.2 DBPN-UD 的硫酸化修饰  81-85
    3.3 DBPN-UD 的羧甲基化修饰  85-89
  4 讨论  89-92
    4.1 DEAE-Sepharose 的应用  89
    4.2 DBPN-UD 硫酸化反应的溶剂选择  89-91
    4.3 DBPN-UD 羧甲基化反应  91-92
  5 小结  92-94
  参考文献  94-95
第六章 DBPN-UD及其衍生物的抗肿瘤活性  95-105
  1 材料  95-96
    1.1 样品  95
    1.2 试剂  95-96
    1.3 仪器  96
  2 实验方法  96-97
    2.1 抑制肿瘤细胞增殖的活性测定（MTT）  96-97
    2.2 抑制半乳凝素-3 活性的测定  97
  3 结果  97-102
    3.1 抑制肿瘤细胞增殖的活性  97-100
    3.2 抑制半乳凝素-3 的活性  100-102
  4 讨论  102
    4.1 DBPN-UD 及其衍生物抑制肿瘤细胞增殖的活性  102
    4.2 DBPN-UD 及其衍生物抑制半乳凝素-3 的活性  102
  5 小结  102-104
  参考文献  104-105
论文总结  105-107
致谢  107-108
在学期间公开发表论文及著作情况  108

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学 > 化学分析与鉴定
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