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蝉蜕抗凝纤溶及细胞保护功能的物质基础研究

作　者: 曹唯仪
导　师: 王玉蓉
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中药制药学
关键词: 蝉蜕抗凝血内皮细胞保护
分类号: R284.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：优选蝉蜕抗凝纤溶活性组分的提取方法,分离纯化蝉蜕该活性组分,对其进行定性分析及稳定性研究,并考察抗凝活性组分对人脐静脉血管内皮细胞的保护作用,探索蝉蜕抗凝纤溶的物质基础。方法：①以PT、APTT、血小板聚集率和血凝-纤溶动态图为指标,比较蝉蜕仿生胃/胰酶解物、水提物、醇提物、水提醇沉物的抗凝与纤溶活性差异,综合评价各提取物抗凝纤溶活性。②PT、APTT、TT、FIB辅以280nm蛋白质检测方法,通过葡聚糖凝胶G-50、G-25、G-10分离蝉蜕胃蛋白酶解物。③以双缩脲反应进行蛋白质定性考察,以HPLC进行纯度考察,通过MALDI-TOF-MS质谱图分析所得活性组分的分子量范围；以PT、APTT、TT为指标考察60℃真空干燥、-20℃冷冻干燥、-80℃冷冻干燥对活性组分稳定性的影响；以APTT为指标考察pH2-7外环境对活性组分稳定性的影响。④以细胞毒性试验,LDH泄漏率,MDA、NO、SOD、GSH-Px等含量为指标,考察分离所得抗凝活性组分对过氧化氢诱导损伤内皮细胞的保护作用。结果：①PTT、血小板聚集率、血凝-纤溶三项指标显示,仿生胃/胰蛋白酶解物和水提醇沉(渣)均表现出显著的抗凝作用,但无延长PT效果,选择胃蛋白酶解物进行后续研究。②经葡聚糖凝胶G-50、G-25、G-10分离蝉蜕胃蛋白酶解物,得到抗凝活性组分F2-2-2。③双缩脲检测结果为紫褐色,表明F2-2-2为蛋白或多肽类物质,纯度以色谱峰面积计76.06%,F2-2-2分子量范围为700-1500Da,特征分子峰为1216.29Da。-80℃冷冻干燥法体外抗凝指标低于空白组,60℃真空干燥法和-20℃冷冻干燥法体外抗凝指标显著高于空白组,-20℃冷冻干燥法抗凝血药效接近浓缩液,为适合抗凝组分的干燥方法。当外环境pH=2时,F2-2-2显著延长APTT；pH≥3时,有絮状不可逆沉淀析出,APTT延长效果减弱；当pH≥5时,抗凝组分不能延长APTT值,并表现出促进凝血效果。④F2-2-2在0.25-0.5mg/ml范围内预孵人脐静脉血管内皮细胞24-72h,显示能显著改善过氧化氢损伤造成的LDH泄漏率增高,MDA和NO释放增高、SOD和GSH-Px抗氧化活性降低。当F2-2-2浓度>4mg/ml,在NO和GSH-Px方面表现出加重氧化损伤现象,当浓度>20mg/ml,细胞存活率小于1%。结论：本实验证明蝉蜕仿生酶解提取物与水提醇沉渣较其他提取物具有良好体外抗凝血效果,并从蝉蜕胃蛋白酶解物中分离纯化得到抗凝血多肽组分F2-2-2,验证其对人脐静脉血管内皮细胞氧化损伤具有保护作用。从中药多靶向角度,揭示了蝉蜕多肽类组分治疗冠心病潜力,并以稳定性研究为其制剂奠定了基础。

全文目录

中文摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
英文缩略词  8-9
文献综述  9-23
  第一部分抗凝血药的研究进展  9-13
  第二部分血管内皮细胞功能与损伤机制  13-20
  第三部分蝉蜕药理作用研究进展  20-23
前言  23-24
技术路线图  24-25
第一部分蝉蜕抗凝组分提取工艺筛选  25-32
  1 材料和方法  25-27
    1.1 仪器  25
    1.2 试药  25
    1.3 蝉蜕不同提取物制备  25-26
    1.4 体外抗凝血药效试验方法  26-27
  2 结果  27-31
    2.1 筛选结果  27-30
    2.2 综合分析  30-31
  3 讨论  31-32
第二部分蝉蜕胃蛋白酶解物抗凝纤溶活性组分分离纯化  32-49
  1 材料和方法  32-34
    1.1 仪器  32
    1.2 试药  32
    1.3 蛋白质检测方法  32-33
    1.4 药效试验方法  33-34
  2 结果  34-47
    2.1 葡聚糖凝胶G-50分离活性组分  34-40
    2.2 葡聚糖凝胶G-25分离活性组分  40-43
    2.3 葡聚糖凝胶G-10分离活性组分  43-47
  3 讨论  47-49
第三部分蝉蜕抗凝血组分理化性质及稳定性初探  49-54
  1 材料和方法  49-50
    1.1 仪器  49
    1.2 试药  49
    1.3 蝉蜕抗凝血组分定性试验——双缩脲法  49
    1.4 蝉蜕抗凝血组分纯度测定实验——高效液相色谱法  49
    1.5 药效试验方法  49-50
  2 结果  50-52
    2.1 蝉蜕抗凝血组分定性试验——双缩脲法  50
    2.2 蝉蜕抗凝血组分纯度测定实验——高效液相色谱法  50
    2.3 蝉蜕抗凝血组分分子量检测试验——飞行时间质谱法  50-51
    2.4 不同干燥条件对蝉蜕抗凝血组分活性影响  51
    2.5 不同pH条件对蝉蜕抗凝血组分活性影响  51-52
  3 讨论  52-54
第四部分蝉蜕抗凝组分对人脐静脉血管内皮细胞保护作用  54-64
  1 材料和方法  54-55
    1.1 仪器  54
    1.2 试药  54
    1.3 细胞培养方法  54
    1.4 样品液配制  54
    1.5 细胞毒性试验(MTT法)  54-55
    1.6 LDH、MDA、NO、SOD、GSH-Px含量检测  55
  2 结果  55-63
    2.1 细胞毒性试验(MTT法)  55
    2.2 抗凝血组分对H_2O_2诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用  55-63
  3 讨论  63-64
结论与讨论  64-66
参考文献  66-73
致谢  73-74
个人简历  74

蝉蜕抗凝纤溶及细胞保护功能的物质基础研究

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