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灵芝基因组中漆酶基因簇的生物信息学分析及Cu²⁺诱导表达

作　者: 陈岳文
导　师: 刘东波
学　校: 湖南农业大学
专　业: 药用植物资源工程
关键词: 灵芝漆酶生物信息学 Cu2+ 诱导表达
分类号: R282
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

灵芝(Ganoderma lucidum)是一类白腐菌,目前人们对其分解利用木质素的酶系统研究很少,随着灵芝基因组数据的公布,可以在基因组水平快速对真菌的木质纤维素降解酶编码基因进行注释和统计。目前功能基因注释方法不完善容易造成基因注释结果的不准确,对于漆酶及其编码基因的表达调控研究不够造成目前对漆酶基因的转录调控机理并不清晰。因此,本文通过对灵芝漆酶基因家族基因Lacc1-Lacc16及其推断氨基酸序列进行生物信息学分析,根据漆酶特性用Cu2+对灵芝P9菌株中的漆酶进行诱导,并测定灵芝漆酶在不同生长时期酶活,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对漆酶基因Lacc1-Lacc16在不同生长时期和Cu2+诱导下的表达情况进行研究,揭示芝漆酶基因及其启动子结构与其转录表达的内在关系,为进一步探索漆酶基因的调控机制提供依据,并且为灵芝漆酶基因的功能基因组研究打下基础。研究结果如下：1、SignalP结果显示Lacc2、Lacc7和Lace11的氨基酸序列中不含有信号肽。Blastp结果显示Lacc1-Lacc16的氨基酸序列中均含有3高度保守铜氧化酶(Cu-oxidase)结构域,其中Lacc12的氨基酸序列与Dichomitus squalens LYAD-421SSI的Fet3protein具有79%的最大相似性,结合系统发育树可见Lacc12的氨基酸序列与其余氨基酸序列的亲缘关系较远,且多序列比对结果显示Lacc12缺失L2漆酶特征序列中保守的1个半胱氨酸残基,因此Laccl2极有可能是铁氧化酶的编码基因。2、通过在灵芝菌株培养基中加入终浓度为150μmol/L的Cu2+,结果显示漆酶同工酶的表达受到Cu2+的诱导调控,漆酶酶活在第4、6、8、12天分别被诱导上调1.52、2.86、2.07和4.00倍。3、生物信息学分析显示Lacc1-Lacc16基因的上游启动子区域中均含有不同的顺式作用位点如金属响应元件(MRE)、压力响应位点(STRE)、CreA因子结合位点(CreA-bingding site)、氮因子结合位点(NIT)、外源响应元件(XRE)、抗氧化响应元件(ARE)等,其中也包括CAAT、TATA等核心转录起始位点。通过对基因的表达分析发现Laccl、Lacc2、Lacc3、Lacc6、Lacc9基因在Cu2+加入后相比于其他基因受到强烈的上调,且它们的上游启动子中均含有MRE,我们可以推测这些基因中可能存在金属响应途径。但是Lacc4的上游启动子中含有3个MRE, Lacc10含有4个MRE,而它们在不同的生长时期几乎不受到Cu2+的诱导调控,因此我们得到一个推论是于基因上游启动子区域的MRE数量多少与基因受到金属离子的诱导作用的强弱并无直接关系。4、Lacc1、Lacc2、Lacc9、Lacc11、Lacc14、Lacc15等只在灵芝特定的生长时期受到Cu2+的诱导调控,对于这种现象我们得到了两种推论：一是随着培养时间的增加,培养条件的变化而引起的基因特定时间表达；二是这些漆酶基因编码的蛋白质在灵芝体内发挥的生理学功能不相同而引起的不同时间表达。5、Lacc7、Lacc9、Lacc11、Lacc14基因无论是在对照组还是Cu2+诱导组中几乎不表达或者极少表达,这种现象的出现很有可能是漆酶基因在进化过程中的基因复制而产生的基因冗余,其普遍存在于真菌和植物的漆酶基因家族中。6、在灵芝生长的第4天,Lacc8基因在对照组和CU2+处理组的表达量都是16个基因中最高,而灵芝对照组漆酶酶活在第4天达到最高为97.20U/mL；处理组的漆酶酶活在第6天达到最高的165.04U/mL,由此可以推断Lacc8与灵芝胞外漆酶的合成有极大的联系。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章前言  12-24
  1 漆酶的研究进展  12-17
    1.1 漆酶的来源  12
    1.2 漆酶的分子特征与结构  12-13
    1.3 漆酶的催化氧化作用  13-14
    1.4 金属离子与漆酶酶活  14-15
    1.5 漆酶的应用  15-17
      1.5.1 造纸领域  15
      1.5.2 生物合成领域  15
      1.5.3 食品领域  15-16
      1.5.4 生物修复领域  16
      1.5.5 改善纤维特性领域  16
      1.5.6 生物传感器领域  16-17
      1.5.7 能源领域  17
  2 漆酶的分子生物学研究  17-21
    2.1 漆酶的氨基酸序列分析  17-18
    2.2 漆酶基因启动子序列  18-19
    2.3 漆酶编码基因家族  19-20
    2.4 真菌基因组中木质素纤维素降解研究  20-21
  3 生物信息学分析工具介绍  21-22
    3.1 美国国立生物技术中心(NCBI)  21
    3.2 PROTEIN BLAST  21
    3.3 SIGNALP 4.1  21-22
    3.4 PROTCOMP 9.0  22
    3.5 DNAMAN  22
    3.6 SOFTBERRY  22
  4 研究目的和意义  22-24
第二章灵芝漆酶基因的生物信息学分析  24-33
  1 材料与方法  24-25
    1.1 研究对象  24
    1.2 漆酶基因推断氨基酸序列结构分析  24-25
      1.2.1 Protein Blast  24
      1.2.2 信号肽及亚细胞位置预测  24-25
      1.2.3 同源性分析  25
      1.2.4 氨基酸多序列比对  25
    1.3 漆酶基因启动子区域分析  25
  2 结果与分析  25-31
    2.1 信号肽及亚细胞定位预测  25-26
    2.2 氨基酸序列结构分析  26-27
    2.3 LACC1-LACC16的进化分析  27-28
    2.4 氨基酸序列的多序列比对  28-30
    2.5 上游启动子区分析  30-31
  4 小结与讨论  31-33
第三章灵芝漆酶酶活测定  33-37
  1 材料与方法  33-34
    1.1 供试菌种  33
    1.2 培养基  33
      1.2.1 平板培养基  33
      1.2.2 深层发酵培养基  33
    1.3 主要生化试剂  33
    1.4 主要仪器与设备  33
    1.5 方法  33-34
      1.5.1 菌丝培养  33-34
      1.5.2 粗酶液的获取  34
      1.5.3 漆酶酶活的测定  34
  2 结果与分析  34-35
  3 小结与讨论  35-37
第四章灵芝漆酶基因的表达分析  37-52
  1 材料与方法  37-42
    1.1 供试菌种  37
    1.2 培养基  37
      1.2.1 平板培养基  37
      1.2.2 深层发酵培养基  37
    1.3 主要生化试剂  37
    1.4 主要仪器与设备  37-38
    1.5 试验方法  38-42
      1.5.1 灵芝菌球的采集  38
      1.5.2 RNA提取用品前处理及准备  38
      1.5.3 灵芝总RNA提取  38-39
      1.5.4 总RNA纯度及浓度检测  39
      1.5.5 第一链cDNA的制备  39-40
      1.5.6 第一链cDNA的质量及浓度检测  40
      1.5.7 半定量PCR反应  40
      1.5.8 实时荧光定量PCR  40-42
      1.5.9 荧光定量PCR数据处理  42
  2 结果与分析  42-49
    2.1 RNA样本的检测及第一链cDNA合成  42-43
    2.2 灵芝不同生长时期漆酶基因的表达情况  43-49
      2.2.1 RT-qPCR分析的有效性  43-46
      2.2.2 Lacc1-Lacc16基因在不同培养时期表达量的变化  46
      2.2.3 在Cu~(2+)的诱导下Lacc1-Lacc16基因转录水平的变化  46-49
  3 小结与讨论  49-52
总结、创新与展望  52-53
  1 本文的创新点  52
  2 展望  52-53
参考文献  53-59
致谢  59-60
作者简介  60

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